Анфинсенова хипотеза (такође позната и као термодинамичка хипотеза) је постулат у биофизичкој хемији постављен од стране америчког хемичара Кристијана Б. Анфинсена. Хипотеза тврди да је, бар за мале глобуларне протеине, нативна конформација одређена минимумом Гибсове слободне енергије система и тако представља, термодинамички гледано, најстабилнију конформацију. Из ове хипотезе следи да је нативну конформацију протеина могуће одредити полазећи само од примарне аминокиселинске секвенце и општих физичко-хемијских принципа. Анфинсен је заједно са сарадницима дошао до горе изнесених закључака након низа експеримената изведених педесетих година двадесетог века и за ова открића је добио Нобелову награду 1972. године.
Увод
Питање увијања протеина је један од главних проблема који стоје пред великим бројем научника из различитих области. Информација о аминокиселинској секвенци садржана је у ДНК и када једном дође до експресије гена и његовог превођења у ланац аминокиселина, протеин релативно брзо, у зависности од сложености, прелази из развијеног облика у физиолошки активну (нативну) конформацију. Питање чиме је одређена терцијарна структура и термодинамичка разматрања увијања протеина јавили су се још у првој половини двадесетог века у радовима Вуа, Полинга и МирскогWu, H. Studies on Denaturation of Proteins. XIII. A Theory of Denaturation Chin. J. Phys. 5, 321–344. 1931.Mirsky, A. E., Pauling, L. On the structure of native, denatured and coagulated. Proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 22, 439–447. 1936.. Радом Анфинсена и сарадника показано је да је под одговарајућим физичко-хемијским условима увијање протеина спонтано и одређено само његовом аминокиселинском секвенцом, а да је нативна конформација одређена глобалним минимумом слободне енергије системаAnfinsen, C. B. Principles that govern the folding of protein chains. Science 181, 223–230. 1973. (Нобеловско предавање). Убрзо након рада Анфинсена, јавила су се гледишта да је увијање протеина кинетички контролисано и да нативна конформација не мора да буде глобални минимум енергије. Расправе о односу термодинамичке и кинетичке контроле увијања протеина и даље се воде, а проблем увијања остаје отворен.
Анфинсенови експерименти
мини|десно|300п|РНаза А
Анфинсен и сарадници су вршили експерименте на рибонуклеази А (РНаза А) изолованој из говеђег панкреаса. То је мали једноланчани протеин укључен у процесе репликације ДНК. Састоји се из 124 аминокиселине и у нативној конформацији садржи 4 дисулфидна моста. У овим експериментима РНаза је денатурисана 8 -{М}- урејом, а њени дисулфидни мостови су редуковани β-меркаптоетанолом. Након овог третмана РНаза је потпуно изгубила активност. Да би РНаза повратила активност она мора приликом увијања да формира 4 дисулфидна моста на тачно дефинисаним положајима. У случају да је формирање дисулфидних мостова стохастички процес, вероватноћа формирања праве комбинације дисулфидних мостова је
У случајевима када је ренатурација ензима вршена у присуству 8 М уреје, коначни препарат је показивао само 1% укупне активности, одакле је закључено да је формирање дисулфидних мостова под овим условима случајно.
Када је овако добијеном препарату додат β-меркаптоетанол, ензим је након десетак сати потпуно повратио активност, одакле су Анфинсен и сарадници закључили да су сви молекули са погрешном комбинацијом дисулфидних веза прешли у облик са правилним распоредом. У другом делу експеримента оксидација ензима је вршена уз истовремено уклањање урее дијализом. Добијени препарат је показивао 100% активности. Процес ренатурације је био значајно убрзан у случају да су у раствору све време били присутни трагови β-меркаптоетанола. С друге стране, време потребно за ренатурацију се смањује на 2 минута у присутву ензима протеин-дисулфид-изомеразе који катализује измену дисулфида.
Да би се искључила претпоставка да је ренатурација РНазе последица заостајања делова уређене структуре у денатурисаној РНази, експерименти су извршени и са хемијски синтетисаном РНазом. Резултати који су добијени са овим препаратом ензима су били идентични онима који су добијени са денатурисаним ензимом.
На основу ових резултата Анфинсен и сарадници су закључили да је нативна форма ензима термодинамички најстабилнији облик, а да је главна покретачка сила увијања концертована интеракција бочних ланаца аминокиселинских остатака распоређених око примарне секвенцеHaber, E., Anfinsen, C. B. Side-chain Interactions Governing the Pairing of Half-cystine Residues in Ribonuclease. J. Biol. Chem. 237, 1839–1844. 1962.. Другим речима, хипотеза тврди да је тродимензионална структура нативног протеина у његовом нормалном физиолошком миљеу (растварач, -{pH}-, јонска сила, присуство других компонената као што су метални јони или простетичне групе, температура и сл.) она у којој Гибсова слободна енергија целог система има глобални минимум, односно да је нативна конформација у датом окружењу одређена свеукупношћу међуатомских интеракција и стога аминокиселинском секвенцом.
Термодинамички аспекти увијања протеина
Процеси денатурације и ренатурације протеина се могу разматрати чисто термодинамички, не улазећи у типове интеракције у молекулу или молекула са растварачем. Процес се може посматрати према моделу два стања, при чему примењивост добијених резултата директно зависи од валидности претпоставки на којима почива модел у реалном систему. Према овом моделу, прелаз између два стања није праћен нагомилавањем стабилних интермедијера који се могу експериментално детектовати, а протеин се сматра потпуно увијеним или потпуно развијенимLattman, E. E., Rose, G. D. Protein folding- what's the question? Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 439–441. 1993.. Равнотежа се може приказати једначином:
РН
где је са Н означена нативна конформација протеина, а са Р развијени облик. Треба нагласити да ова једачина не представља хемијску реакцију јер не долази до формирања ковалентних веза.
Прелаз може бити изазван променом температуре, вредности -{pH}- средине или додатком (уклањањем) неког денатуришућег агенса. Горња равнотежа се може окарактерисати одговарајућим термодинамичким функцијама, Гибсовом слободном енергијом реакције (-{ΔG}-), енталпијом (-{ΔH}-) и ентропијом (-{ΔS}-). Константа равнотеже је дефинисана са:
(са [-{N}-] и [-{R}-] су означене концентрације нативног и развијеног облика) и повезана је са променом слободне енергије развијања преко:
Развијање протеина је праћено повећањем енталпије и ентропије (за горњу реакцију -{ΔH<0, ΔS<0}-).
мини|десно|300п|Хипотетички прелаз протеина чије се понашање описује моделом два стања. Денатурант може бити неки хемијски агенс или температура (види у тексту); код протеина са више домена сваки од њих се појединачно развија, а олигомерни протеини прво дисосују на субјединице.
Из великог броја експерименталних података закључено је да је увијен облик протеина само мало стабилнији од развијених облика. Експерименталне вредности разлике слободне енергије између увијених и развијених облика глобуларних протеина у физиолошким условима се крећу између -20 и -60 -{KJmol}--1, што значи да је средња стабилишућа слободна енергија по аминокиселинском остатку мања од средње енергије термалног кретања (2,5 -{KJmol}--1 на 300˚К) под истим условимаCooper, A. Thermodynamics of Protein Folding and Stability, u: Protein: A Comprehensive Treatise, Vol. 2, Ed: Allen, G. JAI Press Inc. 217-270. 1999.. Ови резултати указују на кооперативну природу увијања протеина: индивидуалне интеракције су недовољне да одрже стабилну конформацију, али заједнички, концентровано, су у стању да то учинеPrivalov, P.L. Stability of proteins: Proteins which do not present a single cooperative system. Adv. Protein Chem. 35, 1-104. 1982..
У светлу статистичке термодинамике, под денатуришућим условима могуће је посматрати ансамбл молекула протеина у развијеном облику насумично распоређен преко огромног дела површи слободне енергије (ПСЕ, ). Према Левинталу (види ниже), број могућих конформација је астрономски, али при постизању услова погодних за увијање (физиолошких) процес увијања може да буде завршен у временском интервалу милисекунди или чак микросекунди, код неких протеина. Према појединој литературиFrauenfelder, H., Sligar, S. G., Wolynes, P. G. The energy landscapes and motions of proteins. Science 254, 1598–1603. 1991.Bryngelson, J. D., Onuchic, J. N., Socci, N.D., Wolynes, P. G. Funnels, pathways, and the energy landscape of protein folding: a synthesis. Proteins 21, 167–195. 1995. под условима погодним за увијање, ПСЕ је облика (вишедимензионалног) левка (сливника, ). Без обзира где су се појединачни молекули протеина затекли на ПСЕ, они прате градијент потенцијалне енергије ка енергетски повољнијем стању. Другим речима није дефинисан пут којим сви молекули долазе до нативне конформације. Аналогон оваквом понашању је лопта која се котрља низ стрмину. У светлу Анфинсенове хипотезе, профил ове ПСЕ под условима погодним за увијање протеина, одређен је искључиво аминокиселинском секвенцом. Профил ПСЕ у денатуришућим условима је, с друге стране, независан од примарне секвенцеRose, G. D., Fleming, P. J., Banavar, J. R., Maritan, A. A backbone-based theory of protein folding. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 16623–16633. 2006..
Ипак треба нагласити да реално „нативна структура“ није једна тачка у конформационом простору, него читав ансамбл фазних тачака, локализован у одређеном делу простора, тако да сви молекули ансамбла имају иста кључна својства за обављање биолошке функције.
Однос термодинамике и кинетике увијања протеина
Анфинсенова хипотеза тврди да је нативна конформација ензима термодинамички најповољнија и да је ензим постиже, али не говори на који начин ензим прелази из развијеног облика у физиолошки активну конформацију, односно којим путем се креће преко ПСЕ. Другим речима, она не говори ништа о механизму увијања као ни о томе којом брзином се одвија овај процес. Одговоре на ова питања покушава да да кинетика увијања протеина.
Анфинсенова хипотеза је до почетка деведесетих година двадесетог века била широко прихваћенаDill, K. A. Dominant forces in protein folding. Biochem. 29, 7133-7155. 1990., али су је неки нови експериментални резултати довели у сумњу. Главна експериментална потврда термодинамичке хипотезе су биле серије експеримената развијање/увијање на малим протеинским молекулима који су показали да је овај процес реверзибилан. У прилог хипотези је такође ишла чињеница да увијање протеина -{in vivo}- и -{in vitro}- има исти крајњи резултат иако се у другом случају полази од потпуно развијеног протеина. Међутим, неки експериментални резултати наводе на закључак да и увијање протеина -{in vivo}- ефективно почиње тек када се синтеза завршиBeckmann, R. P., Mizzen, L. A., and Welch, W. J. Interaction of Hsp70 with newly synthesized proteins: implications for protein folding and assembly. Science 248, 850-854. 1990..