Le ene-reduttasi (ER) sono un gruppo di enzimi dipendenti da nicotinammide adenina dinucleotide fosfato NADPH, capaci di catalizzare la riduzione stereoselettiva di doppi legami carbonio-carbonio (C=C) attivati da gruppi elettron-attrattori (EWG), come aldeidi, chetoni ed esteri. A differenza della tradizionale idrogenazione chimica stereoselettiva, che spesso utilizza metalli nobili e condizioni di reazione drastiche, le ene-reduttasi possono operare in condizioni blande e in ambiente acquoso e la loro stereoselettività dipende dallo specifico enzima utilizzato.
Classificazione Le ene-reduttasi sono classificate come ossidoreduttasi (EC 1) e possono essere divise in due ampie categorie in base al meccanismo di riduzione utilizzato:
Enzimi flavina-dipendenti. Enzimi flavina-indipendenti.
Entrambe le classi richiedono, per le reazioni naturali, quantità catalitiche di NAD(P)H come cofattore riducente, il quale viene spesso rigenerato in situ.
Ene-reduttasi flavina-dipendenti Le ene-reduttasi flavina-dipendenti svolgono le loro reazioni utilizzando il cofattore flavin mononucleotide (FMN), che è legato non covalentemente al sito attivo dell'enzima, e il loro meccanismo catalitico è oggi ben compreso.
Nel ciclo naturale, il cofattore (FMN) viene prima ridotto dal NAD(P)H, dopodiché l'$\text{FMNH}_2$ ridotto riduce il substrato tramite un trasferimento di idruro di tipo Michael sull'atomo di carbonio β. Infine, la protonazione dell'anione risultante avviene nella faccia opposta del doppio legame C=C attraverso un residuo di tirosina o il solvente. La reazione complessiva è una anti-trans-idrogenazione. Questo meccanismo catalitico può essere sostenuto a partire dal cofattore nicotinamidico naturale mediante una rigenerazione del cofattore con un differente substrato, oppure tramite l'uso di riducenti sintetici e metodi di rigenerazione elettrochimica o fotochimica.
La famiglia più predominante di ene-reduttasi flavin-dipendenti è la famiglia di ossidoreduttasi del Old Yellow Enzyme (OYE) (EC 1.6.99.1). Il primo OYE fu scoperto nel lievito di birra (Saccharomyces cerevisiae) nel 1933, e il suo nome deriva dal colore giallo che assume quando è concentrato, dovuto proprio al cofattore flavinico.Warburg O, Christian W. Über das gelbe Ferment und seine Wirkung. Biochem Z 1933;266:377–411 [in German]. Gli OYE catalizzano la riduzione di composti α,β insaturi, mostrando un'elevata specificità per i gruppi attivanti contenenti aldeidi, chetoni o nitrogruppi. Al contrario, gli acidi carbossilici e i loro derivati, come gli esteri e i nitrili, risultano meno attivati e sono considerati "substrati limite" .
Un'altra famiglia di ene-reduttasi flavina-dipendenti, specializzata per i substrati contenenti acidi carbossilici ed esteri, è costituita dalle enoato reduttasi sensibili all'ossigeno (EnoR; EC 1.3.1.31), che contengono il flavin adenine dinucleotide (FAD) e il gruppo prostetico [4Fe−4S].
Ene-reduttasi flavina-indipendenti Le ene-reduttasi flavina-indipendenti sono in grado di ridurre i loro substrati direttamente utilizzando il cofattore NAD(P)H, il quale può essere rigenerato. Due famiglie appartenenti a questo gruppo sono le deidrogenasi/reduttasi a catena media (MDR; EC 1.3.1) e le deidrogenasi/reduttasi a catena corta (SDR; EC 1.1.1.207−8).
I tipici substrati ridotti da questi enzimi includono alcheni aromatici e monociclici contenenti aldeidi o chetoni come gruppi attivanti.
Applicazioni nella sintesi di prodotti chimici fini Esistono diversi esempi di produzione di prodotti chimici fini tramite approcci di biologia sintetica in cui le ene-reduttasi sono impiegate per catalizzare una delle fasi biocatalitiche:
Gli acidi aromatici acido 3-fenilpropionico (3PPA) e acido 3-(4-idrossifenil)propionico (HPPA) sono importanti materie prime utilizzate nei settori chimico, farmaceutico e alimentare. Per sintetizzare questi composti è stata progettata una via biosintetica combinando la via metabolica della fenilalanina nativa di Escherichia coli con enzimi eterologhi, come la tirosina ammonio liasi (TAL) e l'enoato reduttasi (EnoR) di origine clostridica. L'intero pathway è stato assemblato in Escherichia coli, portando alla produzione di HPPA e alcol cinnamico. L'ottimizzazione dei livelli di espressione dei singoli enzimi ha permesso di produrre 3PPA e HPPA con concentrazioni rispettivamente di 367 e 225 mg/L; in questo caso, le EnoR sensibili all'ossigeno sono risultate cataliticamente attive sotto condizioni di fermentazione microaerofila. L'acido 2-metilsuccinico (2-MSA) è impiegato per sintetizzare polimeri che trovano applicazione come bioplastiche, solventi cosmetici e rivestimenti. Un pathway per la sua sintesi è stato progettato in Escherichia coli, combinando la biosintesi nativa del piruvato e dell'acetil-CoA con la citramalato sintasi metanogenica (CimA), l'isopropilmalato isomerasi (LeuCD) e le ene-reduttasi YqjM o KpnER provenienti da Klebsiella pneumoniae. La produzione di 2-MSA è stata ottenuta con successo raggiungendo una concentrazione di 0,96 g/L tramite l'utilizzo dell'enzima KpnER.
Ene-reduttasi: promiscuità enzimatica In studi recenti, le ene-reduttasi flavina-dipendenti hanno dimostrato una notevole promiscuità catalitica, in particolare nella catalisi guidata da foto-ene-reduttasi. Le reazioni non naturali che possono essere eseguite possono essere suddivise in reazioni idruro-dipendenti e idruro-indipendenti:
Reazioni idruro-dipendenti: in natura le ene-reduttasi promuovono un attacco di idruro sul carbonio β di un doppio legame (C=C) attivato, modificandone la densità elettronica. Questa capacità catalitica permette la riduzione di altri gruppi funzionali su una varietà di substrati non naturali, inclusa l'idrogenazione di nitrogruppi, ossime attivate, alchini attivati e composti α,β-dicarbonilici, così come la desaturazione di composti carbonilici saturi. Reazioni idruro-indipendenti: le ene-reduttasi possono catalizzare reazioni basandosi su una sorgente esterna di elettroni per ridurre il cofattore flavinico, avviando in questo modo il ciclo di reazione. In alternativa, una reazione di desaturazione può basarsi sulla riduzione della flavina guidata dal substrato per promuovere il ciclo catalitico. Tuttavia, non tutte le reazioni idruro-indipendenti dipendono meccanicisticamente dal cofattore flavinico o dal coinvolgimento del processo di trasferimento di idruro. Alcuni esempi di queste trasformazioni includono l'isomerizzazione del legame (C=C), la Condensazione di Knoevenagel, la Reazione di Morita-Baylis-Hillman e le reazioni radicaliche.
Note
Categoria:Enzimi