Ustanowił rekordy prędkości samolotu, wiele z nich osiągając na skrajnie trudnym pilotażowo samolocie Gee Bee.
Jego najistotniejszym wkładem w rozwój lotnictwa było jednak opracowanie techniki latania przy pomocy instrumentów. Jako pierwszy pilot wystartował, wykonał lot i wylądował samolotem korzystając wyłącznie z instrumentów pokładowych. Był współtwórcą sztucznego horyzontu.
W styczniu 1942, w randze podpułkownika, został członkiem sztabu Sił Lotniczych Armii. Przygotował – i zgłosił się na ochotnika do prowadzenia – pierwszego amerykańskiego nalotu na Japonię. Z powodu spotkania z japońskim okrętem patrolowym, który został zatopiony podjęto decyzje wcześniejszego o dziewięć godzin startu, co wydłużyło drogę do przelotu o ok. 250 mil. 18 kwietnia 1942 16 średnich bombowców B-25 Mitchell, z których dla odciążenia wymontowano płyty pancerne i częściowo uzbrojenie, pilotowanych przez ochotników, wystartowało z lotniskowca Hornet i zaatakowało cele w Tokio, Kobe, Osace i Nagoi. Misja miała niewielkie znaczenie militarne, ale dała ogromny efekt propagandowy. Sam Doolittle wyskoczył ze spadochronem nad Chinami i powrócił do USA.