Ostatni etap to przekształcenie otwartej formy łańcuchowej do pięcioczłonowej formy pierścieniowej.
Fosforylacja fruktozo-6-fosforanu thumb|250px|Struktura fosfofruktokinazy 1 (PFK-1). class=skin-invert-image|130px ATP ADPclass=skin-invert-imageFosfo-frukto-kinaza class=skin-invert-image|130px β-D-Fruktozo-6-fosforan β-D-Fruktozo-1,6-bisfosforan Fosforylację fruktozo-6-fosforanu przy użyciu ATP przeprowadza enzym fosfofruktokinaza I (PFK-1, ATP-fosfofruktokinaza), powstaje fruktozo-1,6-bisfosforanu oraz ADP. Reakcja ta jest nieodwracalna w warunkach fizjologicznych.
W komórkach roślin wyższych i części niższych fosforylacja fruktozo-6-fosforanu może zachodzić przy udziale fosfofruktokinazy lub 1-fosfotransferazy pirofosforan-fruktozo-6-fosforan (PPi-fosfofruktokinaza). Ten drugi enzym przeprowadza reakcję fosforylacji zużywając nie ATP, lecz pirofosforan, a katalizowana reakcja jest odwracalna. W tkankach młodych fruktozo-1,6-bisfosforan powstaje głównie w wyniku reakcji przeprowadzanej przez PPi-fosfofruktokinazę, a w tkankach starszych ATP-fosfofruktokinazę.