Panowanie króla Stefana Batorego było określane jako „złote lata” miasta. Król lubił Grodno i mieszkał na zamku wiele lat. Przyjmował w mieście poselstwa, zwoływał w nim radę senatu, przedsięwziął starania by założyć w mieście kolegium jezuickie. Za jego panowania zamek ok. 1580 r. przebudowano w stylu renesansowym pod kierownictwem architekta Scoto z Parmy. Grodno stało się kwaterą główną króla w czasie wojny polsko-rosyjskiej 1577–1582. Zmarł na zamku w Grodnie 12 grudnia w 1586 roku, w czasie przygotowań do kolejnej wojny z Moskwą, podczas których polował w Puszczy Molawickiej w Kundzinie, gdzie w nagłej chorobie został opatrzony ostatnimi sakramentami przed przewiezieniem do pobliskiego miasta nad Niemnem.
W 1602 rozpoczęto budowę kościoła i klasztoru bernardynów, który w 1618 wyświęcił biskup Eustachy Wołłowicz. Klasztor w następnych wiekach był siedzibą sejmików powiatowych szlachty grodzieńskiej. W 1621 do miasta przybyli jezuici. W 1624 miasto dotknęło morowe powietrze. W 1635 starosta upicki Eustachy Kurcz ufundował kościół franciszkanów. Około 1642 ukończono budowę kościoła i klasztoru Brygidek. Po unii brzeskiej w mieście założono też klasztory dominikanów i karmelitów.