thumb|Stałe i płynne kultury mikroorganizmów przechowywane w lodówce Kultura mikroorganizmów, hodowla mikroorganizmów – rodzaj hodowli komórkowej, polegającej na utrzymywaniu przy życiu i namnażaniu mikroorganizmów (wzrost mikroorganizmów).

Wzrost mikroorganizmów rozumiany jest jako przyrost biomasy mikroorganizmów jednokomórkowych (jak drożdże, bakterie) lub wielokomórkowych (jak strzępki grzybów pleśniowych) w wyniku biosyntezy substancji komórkowych (np. białek, węglowodanów, kwasów nukleinowych). Wzrost mikroorganizmów można również rozumieć jako przyrost biomasy związany z rozwojem populacji, tzn. zwiększenie zbioru organizmów danego szczepu w danym środowisku.

Kultury mikroorganizmów są szeroko stosowane w biotechnologii, wykorzystuje się je m.in. do pozyskania ich metabolitów pierwotnych i wtórnych, w celu biotransformacji, bioremediacji oraz w biologii molekularnej. Techniki kultury mikroorganizmów pozwalają na wyizolowanie i identyfikację mikroorganizmów w celach badawczych i diagnostycznych.

Metabolizm mikroorganizmów Mikroorganizmy pod względem strategii metabolicznej można podzielić:

ze względu na źródło węgla: autotrofy – pozyskują węgiel przez asymilację ; heterotrofy – pozyskują węgiel ze związków organicznych; ze względu na sposób odżywiania: prototrofy – z podstawowych składników pokarmowych potrafią zsyntetyzować dla siebie czynniki wzrostowe takie jak aminokwasy, zasady purynowe i pirymidynowe oraz witaminy; auksotrofy – mikroorganizmy uzależnione od obecności powyższych dodatkowych substancji odżywczych w pożywce; ze względu na źródło energii: fototrofy – pozyskują energię z promieniowania słonecznego; chemotrofy – pozyskują energię z utleniania organicznych lub nieorganicznych związków chemicznych; ze względu na źródło elektronów: litotrofy – źródłem elektronów są związki nieorganiczne, np. , , ; organotrofy – źródłem elektronów są związki organiczne; ze względu na preferowaną temperaturę: psychrofile – osiągające optymalne warunki wzrostu w temperaturze w zakresie od 0 do 20 °C; mezofile – maksymalna szybkość ich wzrostu ma miejsce w zakresie temperatur 20–42 °C; termofile – rosną najlepiej w temperaturach 40–70 °C, a termofile ekstremalne nawet w wyższych, dochodzących do 105 °C.

Podłoża mikrobiologiczne Podłoża mikrobiologiczne stosuje się do izolacji, różnicowania, identyfikacji, namnażania i badania mikroorganizmów, a także do pozyskiwania określonych produktów ich metabolizmu. Stanowią sztuczne środowisko dla ich wzrostu.

Pożywki, na których hodowane są drobnoustroje, można podzielić na płynne i stałe. Hodowle płynne można prowadzić w probówkach, kolbach, butlach lub bioreaktorach. Dla równomiernego rozprowadzenia substancji odżywczych i populacji mikroorganizmów może być konieczne stosowanie mieszania, a dla ułatwionej wymiany gazowej – napowietrzania. W hodowli na niewielką skalę (w kolbkach) wykorzystuje się w tym celu wytrząsarki; w hodowli na dużą skalę (w biofermentorach) – mieszadła mechaniczne. Ze względu na występowanie wielu związków odżywczych w pożywce oraz możliwość pozakomórkowego wydzielania różnych związków przez drobnoustroje wytwarzać może się nadmierna piana. Aby temu zapobiec, stosuje się środki antypienne. Hodowle na podłożach stałych prowadzi się na szalkach Petriego, skosach, słupkach.

Agar to uniwersalna substancja zestalająca pożywki, nieulegająca rozkładowi przez większość mikroorganizmów. Pożywki stałe zawierają 1,5–2% agaru, a półpłynne – 0,1–0,7%. Inną substancją zestalającą pożywki jest żelatyna. Tworzony przez nią żel upłynnia się jednak w temperaturze 22–25 °C, dlatego ma ograniczone zastosowanie w hodowli bakterii.

Pożywki płynne służą przede wszystkim do namnażania drobnoustrojów, a także do przeprowadzania testów biochemicznych; półpłynne – do badania cech takich jak ruch, sprzyjają wzrostowi anaerobicznemu; stałe wykorzystuje się do uzyskania wzrostu powierzchniowego w celu obserwacji wyglądu, specyficznych reakcji biochemicznych, izolacji czystych kultur, przechowywania mikroorganizmów, różnicowania drobnoustrojów, a także namnażania.

Pożywki stosowane w kulturach mikroorganizmów powinny wykazywać następujące cechy: muszą zawierać przyswajalne dla mikroorganizmów źródła pierwiastków biogennych, energii i soli mineralnych; powinny wykazywać optymalne pH, potencjał oksydoredukcyjny i odpowiedni poziom ciśnienia osmotycznego dla danego mikroorganizmu; muszą być jałowe.

Podłoża ze względu na zawartość składników odżywczych można podzielić na: minimalne – zawierają tylko składniki pokarmowe niezbędne do podtrzymania wzrostu mikroorganizmów; pełne – zawierają wszystkie związki odżywcze niezbędne dla dobrego wzrostu, np. bulion odżywczy do hodowli bakterii, brzeczka do hodowli drożdży; wzbogacone – sporządzane dla mikroorganizmów, które słabo rosną , wymagają dodatkowych substancji odżywczych jak np. krew, surowica, wyciąg wątrobowy, mleko, żółtka jaj.

Autotrofy hoduje się zwykle na podłożach minimalnych, bez związków organicznych lub z dodatkiem prostych związków. W przypadku heterotrofów stosuje się często podłoża bogate w substancje organiczne.

Źródłem azotu są zwykle aminokwasy i peptydy. Wiele jednak mikroorganizmów, zwłaszcza te żyjące w warunkach naturalnych, wykazuje zdolność wykorzystywania azotu z soli amonowych, azotanów, azotynów, a nawet azotu atmosferycznego. Źródłem siarki są zwykle aminokwasy siarkowe, siarczyny, siarczany, siarkowodór, a rzadziej siarka elementarna. Poza tym drobnoustroje wymagają soli mineralnych, które utrzymują odpowiednie ciśnienie osmotyczne i pH, pełnią ważną rolę w metabolizmie lub są składnikami związków w komórkach.

Do przygotowania podłoży do hodowli heterotrofów wykorzystuje się najczęściej wyciągi z tkanek zwierzęcych, np. bulion (wyciąg mięsny). Nieliczne heterotrofy są prototrofami zdolnymi do wzrostu na podłożu zawierającym jedynie prosty związek organiczny (jak glukoza) i sole mineralne.

Podłoża ze względu na zastosowanie można podzielić na: namnażające – bogate, do pozyskiwania dużej ilości biomasy; wybiórczo-namnażające (selektywne) – mające w składzie substancje umożliwiające wzrost określonych mikroorganizmów i hamujące wzrost innych; różnicujące (izolacyjne) – mające w składzie indykator pozwalający na odróżnienie określonych grup mikroorganizmów; wybiórczo-różnicujące – łączące właściwości podłoży selektywnych i różnicujących; transportowe – minimalne, pozwalające na utrzymanie żywotności mikroorganizmów podczas transportu; transportowo-wzrostowe – pozwalają na namnażanie drobnoustrojów w trakcie przechowywania, transportu i inkubacji.

Zasady hodowli mikroorganizmów Ogólne zasady hodowli mikroorganizmów Przenoszenie drobnoustrojów ze środowiska naturalnego na pożywkę lub z pożywki na pożywkę nazywa się posiewem. Najważniejszym jego aspektem jest niedopuszczenie do zakażenia, w związku z czym muszą być zachowane warunki sterylne.

Szybkość wzrostu mikroorganizmów zależy od: rodzaju i szczepu drobnoustrojów; składu pożywki (rodzaj i ilość składników odżywczych, ilość szkodliwych metabolitów); fizycznych i chemicznych warunków wzrostu (temperatura, pH, aktywność wody, potencjał redoks).

W przypadku swobodnego dostępu do składników odżywczych, optymalnych warunków otoczenia, braku szkodliwego działania produktów przemiany materii, wzrost mikroorganizmów odbywa się w sposób nieograniczony.

+ Uogólnione optymalne warunki dla wzrostu poszczególnych mikroorganizmów czynnik bakterie grzyby strzępkowe drożdże wymagania tlenowe tlenowe lub beztlenowe tlenowe z pewnymi wyjątkami względnie beztlenowe wymagania temperaturowe 30 °C lub 37 °C dla chorobotwórczych dla człowieka 20–25 °C 20–25 °C optymalna wartość pH około 7,4 około 5,6 około 5,6 wpływ światła może hamować wzrost lub je zabijać brak wpływu brak wpływu wpływ ciśnienia osmotycznego w silnie hipertonicznych roztworach ulegają plazmolizie; w hipotonicznych pęcznieją i mogą pękać są odporne na wysokie ciśnienie osmotyczne są odporne na wysokie ciśnienie osmotyczne przykładowa pożywka agar tryptonowo-sojowy (TSA), bulion tryptonowo-sojowy (TSB) pożywka Sabourauda, podłoże Czapka-Doxa YPD, brzeczka słodowa

Sterylizacja

Sterylizacja (wyjaławianie) polega na usunięciu wszystkich, wegetatywnych i przetrwalnych form mikroorganizmów. W hodowli mikroorganizmów sterylizuje się m.in. szkło laboratoryjne, instrumenty, pożywki, zużyte hodowle.

Można wyróżnić metody: fizyczne – sterylizacja termiczna sucha, sterylizacja termiczna cieplna (z wykorzystaniem pary wodnej), użycie promieni ultrafioletowych, jonizujących, ultradźwięków; mechaniczne – filtracja; chemiczne.

W laboratorium mikrobiologicznym najczęściej używa się metod sterylizacji termicznej. W metodach suchych stosuje się wyżarzanie (eza i inne drobne metalowe narzędzia), opalanie w płomieniu palnika (brzegi probówek, kolb po wyjęciu korka i przed zakorkowaniem, głaszczki szklane po uprzednim zanurzeniu w alkoholu), sterylizacja gorącym powietrzem polegająca na działaniu temperaturą np. 140 °C przez 2,5 h w suszarkach elektrycznych (szalki Petriego, pipety szklane, a także inny sprzęt laboratoryjny ze szkła lub metalu).

Sterylizację w gorącej nasyconej parze wodnej przeprowadza się w autoklawach, pod zwiększonym ciśnieniem (stosowane do pożywek, szkła i narzędzi laboratoryjnych). Inną metodą sterylizacji termicznej mokrej jest tyndalizacja (dla materiałów, które nie nadają się do wyjaławiania w temperaturze przekraczającej 100 °C, np. niektórych pożywek). Może się ona odbywać w aparacie Kocha służącym do sterylizacji w bieżącej parze wodnej. Pożywki wrażliwe na działanie wysokiej temperatury można też wyjaławiać przez filtrowanie przez filtry z porami o średnicy mniejszej od wymiarów bakterii (zwykle 0,2 µm). Do sterylizacji powietrza i pomieszczeń stosuje się promieniowanie UV.

Hodowla grzybów strzępkowych thumb|Cztery 3-dniowe kolonie grzybów Aspergillus na płytce agarowej W odmienny sposób od bakterii i drożdży rosną grzyby strzępkowe. Ich ciało (plecha) stanowi grzybnia zbudowana ze strzępek. Wyróżnia się grzybnię powietrzną (w postaci puchu, pleśni) oraz substratową (wnikającą w podłoże). W ciekłych pożywkach zazwyczaj tworzy się więcej strzępek substratowych. Poza tym grzyby te wytwarzają zarodniki, które mogą powstawać na drodze płciowej (np. askospory u workowców) lub wegetatywnej (np. konidia, sporangiospory). W podobny sposób jak grzyby strzępkowe rosną również promieniowce. Wzrost grzybów jest wolniejszy niż bakterii, często potrzebują one kilku dni, a nawet tygodni, aby powstały kolonie widoczne gołym okiem.

Hodowle okresowe, półokresowe i ciągłe thumb|Wykres wzrostu bakteriiFaza I – faza adaptacyjnaFaza II – faza wzrostu wykładniczegoFaza III – faza stacjonarna Faza IV – faza wymierania

W hodowlach okresowych jednorazowo zaszczepiona zostaje określona ilość pożywki. Wzrost drobnoustrojów trwa do wyczerpania się substancji odżywczych lub ich zatrucia przez toksyczne produkty metabolizmu. W takich hodowlach zamkniętych nie dodaje się związków odżywczych w trakcie hodowli ani nie odprowadza namnożonej biomasy i produktów metabolizmu. Wzrost drobnoustrojów obejmuje fazy: adaptacji, wzrostu wykładniczego i fazę stacjonarną. Hodowlę kończy się przed fazą wymierania. Jej zaletami są prostota, łatwość utrzymywania sterylnych warunków i zapobieganie degeneracji mikroorganizmów przez odnawialność inokulum. Wadami są jednak niska produkcyjność i brak możliwości regulacji stężenia limitującego czynnika. Hodowle okresowe stosuje się m.in. do namnażania biomasy mikroorganizmów, pozyskiwania metabolitów pierwotnych (w fazie wzrostu wykładniczego) i wtórnych (w fazie stacjonarnej).