HDAC4 () – білок, який кодується однойменним геном, розташованим у людей на короткому плечі 2-ї хромосоми. Довжина поліпептидного ланцюга білка становить 1 084 амінокислот, а молекулярна маса — 119 040.
Кодований геном білок за функціями належить до репресорів, гідролаз, регуляторів хроматину, фосфопротеїнів. Задіяний у таких біологічних процесах як транскрипція, регуляція транскрипції, поліморфізм, альтернативний сплайсинг. Білок має сайт для зв'язування з іонами металів, іоном цинку. Локалізований у цитоплазмі, ядрі.
Як і всі ферменти групи гістондеацетилаз, близької до сиртуїнів, гістондеацетилаза 4 каталізує видалення ацетильних груп із залишків лізину в N-кінцевій частині корових гістонів (, , і H4), що змінює структуру хроматину. Деацилювання гістонів є одним з механізмів транскрипційної та епігенетичної регуляції, впливає на хід клітинного циклу і бере участь в регуляції розвитку. Робота HDAC4 регулюється шляхом різних посттрансляційних модифікацій і взаємодій з різноманітними білками, іноді тканиноспецифічними. Порушення роботи HDAC4 призводить до розвитку багатьох захворювань, зокрема ракових, тому інгібітори HDAC4 можуть мати важливе медичне застосування.
Ген і регуляція експресії У людини ген HDAC4 розташований на 2-ій хромосомі (2q37.3), завдовжки близько 353,49 кілобаз (кб), містить 37 екзонів і дає початок 8980 мРНК-транскриптам. У миші гомологічний ген Hdac4 має довжину близько 215,7 кб, розташовується на 1-ій хромосомі і дає початок 3960 мРНК-транскриптам. HDAC4 експресується в різних тканинах, і рівень експресії залежить від інтенсивності різних стимулів. Попри величезну кількість процесів, регульованих HDAC4, і унікальні механізми регуляції активності цього білка, про механізми регуляції його експресії відомо мало. Фактори транскрипції SP1 і SP3 пов'язуються безпосередньо зі специфічними GC-збагаченими ділянками в промоторі HDAC4 і запускають транскрипцію HDAC4. HDAC4 не експресується в ядрах ембріональних стовбурових клітин миші, однак на початку диференціації клітин рівень його експресії різко зростає.
Показано, що в регуляції експресії HDAC4 беруть участь кілька МікроРНК, серед яких miR-1, miR-29, miR-140, miR-155, miR-200a, miR-206 і miR-365, які діють у клітинах різних типів. miR-200a безпосередньо зв'язується з 3'-нетрансльованою областю (3'-UTR) мРНК HDAC4 і пригнічує його експресію. miR-1 специфічна для клітин м'язів і стимулює , діючи на 3'-UTR мРНК HDAC4 і пригнічуючи експресію HDAC4. Білок mTOR контролює MyoD-залежну транскрипцію miR-1 через вищерозміщений енхансер, а опосередкована miR-1 репресія HDAC4 призводить до утворення фоллістатину і подальшого злиття міоцитів. Тимчасова трансфекція прогеніторних клітин кардіоміоцитів за допомогою miR-1 і miR-499 знижувала швидкість проліферації і викликала посилену диференціацію людських прогеніторних кардіоміоцитів і клітин ембріональних стовбурових клітин у кардіоміоцити через репресію HDAC4. Крім того, miR-22, пригнічена при гепатоцелюлярній карциномі, пригнічує проліферацію і схильність до утворення пухлин через регуляцію HDAC4.
Крім того, надекспресія miR-206 і miR-29 придушувала експресію HDAC4 на рівні трансляції як за присутності, так і за відсутності трансформуючого фактору росту-бета (TGF-β) через взаємодію з 3'-UTR HDAC4. Експресія miR-206 і miR-29, задіяних у диференціації клітин м'язів, негативно регулюється TGF-β, тому обробка міогенних клітин TGF-β викликає підвищену експресію HDAC4. miR-29b виступає ключовим регулятором диференціювання в остеобласти, діючи на білки HDAC4, TGF-β3, ACVR2A, CTNNBIP1 і DUSP2. miR-140, специфічна для хрящової тканини, безпосередньо діє на 3'-UTR HDAC4. Миші, позбавлені miR-140, мають карликовий фенотип через порушення розвитку хондроцитів. miR-365, яка активується при механічному впливі, пов'язана з модуляцією диференціювання хондроцитів, діючи безпосередньо на HDAC4. У , що мають людську miR-155, miR-155 діє на HDAC4 і порушує регуляцію транскрипції гена 6 в В-клітинах. Штучно посилена експресія HDAC4 в людських клітинах В-клітинної лімфоми зменшувала индуковану miR-155 проліферацію і посилювала апоптоз. Все це свідчить про важливу роль мікроРНК, які специфічно діють на HDAC4, в модуляції клітинної відповіді та біологічних функцій клітин різних типів у відповідь на різні стимули.
Структура
Структура доменів
Людський ген HDAC4 кодує білки завдовжки від 972 до 1084 амінокислотних залишків, а мишачий гомолог Hdac4 — від 965 до 1076 амінокислотних залишків. HDAC4 містить унікальний регуляторний домен на N-кінці, який взаємодіє з різними транскрипційними факторами, а цинк-містить каталітичний домен на С-кінці. Аналіз кристалічної структури показує, що правильно фолдований (укладений) цинк-зв'язувальний домен необхідний для формування репресорного комплексу. N-кінцева ділянка мономеру HDAC4 консервативна і містить збагачений глутаміном домен (19 залишків глутаміну з 68), який укладається в пряму альфа-спіраль, що бере участь в збірці тетрамеру гістондеацетилази 4. Тетрамер HDAC4 не має регулярно розташованих неполярних амінокислотних залишків і протяжного гідрофобного кору. Натомість взаємодія між субодиницями забезпечується безліччю гідрофобних острівців, розташованих усередині ділянок з полярними амінокислотними залишками, а глутамін-збагачені ділянки беруть участь у згортанні альфа-спіралей мономерів та їх взаємодії один з одним. С-кінцевий цинк-зв'язувальний домен відіграє ключову роль у розпізнаванні субстрату і зв'язування HDAC4 з репресорним комплексом HDAC3-NCoR. Детальний аналіз кристалічної структури показав, що між цистеїном 669, розташованим у цинк-зв'язувальному домені, і цистеїном 700 сусідньої молекули може формуватися міжмолекулярний дисульфідний зв'язок.
Посттрансляційні модифікації
Посттрансляційні модифікації HDAC4 можуть змінювати його внутрішньоклітинну локалізацію і склад білків, які з ним взаємодіють. Добре відомо, що однією з ключових функцій HDAC4 є репресія транскрипції генів-мішеней через регуляцію конденсації і структури хроматину. Нещодавні дослідження показали критичну роль посттрансляційних модифікацій у контролі клітинних відповідей, у яких задіяна HDAC4. Показано, що HDAC4 може фосфорилюватися, сумоїлюватися, карбонілюватися, убиквітинуватися і розрізатися під дією різних ферментів.
Фосфорилювання Фосфорилювання/дефосфорилювання забезпечує швидку і ефективну репресію гістондеацетилаз (HDAC) класу ІІа, до якого належить і HDAC4. Оборотне фосфорилювання — регуляторний механізм, необхідний для функціювання HDAC4. HDAC4 взаємодіє з сімейством білків 14-3-3, які специфічно зв'язуються з фосфосерин-містними консервативними мотивами. Фосфорилювання цих залишків серину створює сайти зв'язування з шапероном сімейства 14-3-3, який супроводжує фосфорильовану HDAC4 при транспорті з ядра в цитоплазму. HDAC4 може фосфорилюватися такими білками: , ERK1/2, протеїнкіназа А (РКА) і .
Стимуляція CaMK запускає міогенез шляхом руйнування комплексів -HDAC і подальшого експорту HDAC з ядра. специфічно зв'язується з HDAC4 через унікальний сайт докінгу. Фосфорилювання HDAC4 за залишками серину S246, S467 і S632 за допомогою CaMKII посилює ядерний експорт і запобігає ядерному імпортові HDAC4 з подальшою репресією генів-мішеней HDAC4. Передача сигналу через ендогенний CaMKII необхідна для індукованого агоністом накопичення HDAC4 в цитозолі кардіоміоцитів. Однак РКА фосфорилює HDAC4 і регулює протеоліз HDAC4 за залишком тирозину 207, а також виступає антагоністом CaMKII-опосередкованої активації MEF2 шляхом регулювання протеолізу HDAC4. Продукт розрізання HDAC4, що включає в себе N-кінець колишнього білка, селективно інгібує активність MEF2, але не SRF, виступаючи антагоністом CaMKII, але не впливаючи на виживання кардіоміоциту. Активація сигнального шляху Ras-MAPK при експресії онкогенного білку Ras або у разі конститутивно активної MAPK/ERK-кінази 1 викликає накопичення HDAC4 в ядрі міобластів. GSK3 може фосфорилювати HDAC4 за позиціями 298 та 302, що призводить до руйнування HDAC4 протеасомами; таким чином, цей білок слугує важливим регулятором стабільності HDAC4.
Аналогічним чином, важливу роль у регуляції HDAC4 відіграють дефосфорилювальні ферменти — протеїнфосфатази. В умовах in vitro HDAC4 дефосфорилюється PP2A, яка спочатку взаємодіє з N-кінцем HDAC4, а потім дефосфорилює її. Регулюючи дефосфорилювання HDAC4 за кількома залишками серину, зокрема і тими, які входять в сайт зв'язування з білками 14-3-3, а також залишком серину 298, PP2A контролює ядерний імпорт HDAC4.
Карбонілювання Карбонілювання, або алкілування, — характерна посттрансляційна модифікація в клітинах, які зазнали окислювального стресу. Карбонілюванням називається ковалентне приєднання активної карбонільної групи до тіольної групи залишків цистеїну в білкові-субстраті. У відповідь на стимули, що індукують утворення активних форм кисню в клітині, в білку DnaJb5 залишки цистеїну 274 і 276, а в HDAC4 — 667 та 669 окислюються і формують внутрішньомолекулярні дисульфідні зв'язки, які потім можуть бути відновлені тіоредоксином-1. Відновлення залишків цистеїну 274 і 276 білку DnaJb5 необхідне для взаємодії DnaJb5 і HDAC4, а відновлення залишків цистеїну 667 та 669 HDAC4 пригнічує її ядерний експорт незалежно від ступеню фосфорильованості.
Сумоїлювання Сумоїлювання — це ковалентне приєднання білків групи SUMO до залишків лізину білку. Як і при убіквітинуванні, приєднання білків SUMO (SUMO1, SUMO2 і SUMO3) до залишків лізину в білках-субстратах відіграє критичну роль у модуляції активності та руйнування цих білків. Показано, що HDAC4 розпізнається SUMO1 за єдиним залишком лізину (лізин-559), за яким і відбувається сумоїлювання. Воно здійснюється E3 SUMO-протеїнлігазою RANBP2 і не впливає на внутрішньоклітинний розподіл HDAC4, а також на його взаємодію з деякими з білків, з якими вона взаємодіє. Однак HDAC4 з мутацією в позиції 559 значно гірше функціонує і здійснює репресію транскрипції генів-мішеней порівняно з диким типом. Сумоїлювання HDAC4 перешкоджає її фосфорилювання CaMK4.
Убіквітинювання Зазвичай поліубіквітинювання направляє білки на деградацію протеасомами, тоді як моноубіквитинювання може мати різні біологічні ефекти. Убіквітинювання і протеасомне руйнування HDAC4 регулюється шляхом фосфорилювання GSK3β, однак механізм та біологічне значення убіквітинювання HDAC4 ще не з'ясовані.
Протеоліз Переміщення HDAC4 між ядром і цитоплазмою також перебуває під впливом протеолізу, який відбувається в процесі апоптозу. HDAC4 розрізається каспазою-2 і -3 за залишком аспартату 289. N-кінцевий фрагмент HDAC4, відрізуваний каспазами, містить сигнал ядерної локалізації і накопичується в ядрі, репресуючи транскрипцію і викликаючи загибель клітини, а також виступаючи сильним репресором MEF2C. Порівняно з іншими ядерними формами HDAC4, ядерний фрагмент, відрізуваний каспазами, викликає загибель клітини і справляє потужну придушувальну дію на Runx2- або SRF-залежну транскрипцію, попри те що не містить С-кінцевого цинк-зв'язувального домену, необхідного для розпізнавання субстрату і зв'язування з корепресорним комплексом HDAC3-N-CoR. Створюваний каспазами фрагмент слабко зв'язується з хроматином, тоді як HDAC4, яка мутантна за сайтом зв'язування 14-3-3, формує стабільніші комплекси з білком HDAC5.
Дія на клітинному рівні Гістони відіграють вкрай важливішу роль у регуляції експресії генів. Ацетилювання/деацетилювання гістонів змінює структуру хроматину і впливає на доступ факторів транскрипції до ДНК. HDAC4 належить до класу II сімейства гістондезацетилаз/acuc/apha. Він володіє активністю гістондеацетилази і пригнічує транскрипцію, зв'язуючись з промотором. Цей білок не пов'язує ДНК безпосередньо, а лише за допомогою транскрипційних факторів MEF2C і MEF2D. Як і для всіх гістондеацетилаз, для роботи HDAC4 необхідні іони Zn2+.