Regulacija ekspresije (izražanja) genov (˝genska regulacija˝) je celična kontrola nastanka funkcionalnega produkta gena, v zadostni količini in v točno določenem času. Funkcionalni produkt gena je lahko RNA ali pa protein. Znanih je mnogo mehanizmov, ki uravnavajo izražanje protein kodirajočih genov. Pri genskem izražanju je lahko katerikoli korak uravnavan: od DNA-RNA prepisovalnega koraka do posttranslacijske spremembe proteina. Genska regulacija omogoči celici kontrolo nad strukturo in funkcijo in je osnova za celično diferenciacijo, morfogenezo, spremenljivost in prilagoditev pri katerem koli organizmu. Pri regulaciji izražanja genov je znanih več korakov.
Kemijske in strukturne spremembe DNK ali kromatina Kemijske spremembe
Metilacija DNA je eden izmed najpogostejših načinov kemijske spremembe DNA in je prisotna v genomih različnih organizmov. Najdemo jo pri prokariontih in evkariontih. Pri prokariontih se DNA metilacija pojavi na citozinskih in adeninskih bazah in je del gostiteljskega restrikcijskega sistema Lewin B. 2000. Genes VII. Oxford University Press Inc., New York: 990 str. . Restrikcijsko modifikacijski sistemi vsebuje DNA metilaze, ki ščitijo gostiteljsko DNA zaporedje pred restrikcijo, z njihovimi restrikcijskimi encimi, ki razgrajujejo nespremenjeno tujo DNA Reisenauer A., Kahng L. S., McCollum S., Shapiro L. 1999. Bacterial DNA methylation: a Cell Cycle regulator? Journal of Bacteriology, 181, 17: 5135-5139. Pri citozinu se DNA metilacija pojavi na mestu C-5 ali N-4, pri adeninu pa ne mestu N-6. Reakcijo katalizira encim DNA metiltransferaza (MTaza). Kot metilni donor vse MTaze uporabljajo S-adenozil metionin Palmer B. R., Marinus M. G. 1994. The dam and dcm strains of Escherichia coli-a review. Gene, 143, 1: 1-12. Določene metilaze (DNA citozin MTaza (Dcm), DNA adenin metilaza (Dam) in CcrM (cell cycle-regulated methylase)) sodelujejo pri celičnih regulatornih pojavih in kontroli bakterijske virulence Kang S., Lee H., Han J. S., Hwang D. S. 1999. Interaction of SeqA and Dam methylase on the hemimethylated origin of Escherichia coli chromosomal DNA replication. Journal of Biological Chemistry, 274, 17: 11463-11468 Low D. A., Weyand N. J., Mahan M. J. 2001. Roles of DNA adenine aethylation in regulating bacterial gene expression and virulence. Infection and immunity, 69, 12: 7197-7204.
Metilacija adenina lahko prepreči interakcijo regulatornih proteinov z DNA, bodisi s posrednim ali z neposrednim steričnim učinkom na DNA obliko. Pri Escherichia coli Dam regulira izražanje trpR, Tn10 transpozonaze, dnaA in fagnih genov, npr. mom faga Mu Hattman S. 1982. DNA methyltransferase-dependent transcription of the phage Mu mom gene. Proceedings of the National Academy of Science of United States of America, 79, 18: 5518-5521. Metilacija GATC mest, znotraj konsenznih RNA polimeraza vezavnih mest, inhibira (trpR and Tn10 transpozonaza) ali ojača (dnaA) transkripcijo oz. prepisovanje.
DNA vezavni proteini lahko preprečijo metilacijo z vezavo na specifična DNA zaporedja. SeqA protein, ki je vključen pri podvojevanju DNA, se specifično veže na hemimetilirano DNA zaporedje blizu oriC mesta (mesto začetka podvojevanja). Tako onemogoči metilacijo oriC mesta in ga vzdržuje v hemimetiliranem stanju (Kang in sod., 1999). Nekateri regulatorni proteini se z visoko afiniteto vežejo na specifična DNA hemimetilirana zaporedja in tvorijo t. i. DNA metilacijske vzorce (DMP). DMP se tvorijo, ko se regulatorni faktorji vežejo na tarčna mesta DNA, ki prekrivajo ali pa so blizu metilacijskih mest in s tem preprečijo njihovo metilacijo. Tak primer opazimo pri regulaciji ekspresije genov Pap pilusa pri E. coli (Palmer in Marinus, 1994).
Pri E. coli DNK adenin metilaza (Dam) metilira nemetilirana in hemimetilirana GATC mesta podobno. Dam ima pomembno vlogo pri DNA podvojevanju, segregaciji kromosomske DNA, pri popravljanju neujemanja (missmatch repair) in transpoziciji Herman G. E., Modrich P. 1981. Escherichia coli K-12 clones that overproduce dam methylase are hypermutable. Journal of bacteriology, 145, 1: 644-6 Stancheva I., Koller T., Sogo J. M. 1999. Asymmetry of Dam remethylation on the leading and lagging arms of plasmid replicative intermediates. EMBO journal, 18, 22: 6542-6551. Pri vseh teh pojavih hemimetilirana GATC mesta predstavljajo takojšnjo DNA podvojevanje in kontrolo vezave specifičnih proteinov. Segregacija novo nastale podvojene DNA se lahko pojavi z vezavo hemimetilirane DNA na membranske faktorje. Pri popravljanju neujemanja se MutH veže na hemimetilirano DNA in odreže segment z napačno vstavljeno bazo. Nastane 3-OH' konec in polimeraza lahko nadaljuje sintezo Cooper G. M. 1996. The cell: a molecular approach. ASM Press, Washington, D. C., Sinauer Associates, Inc. Sunderland, Massachusetts: 673 str.. Določene transpozoaze, tudi Tn10, se vežejo z visoko afiniteto na hemimetilirana mesta in tako limitirajo transpozicijo (Lewin, 2000). Dam ima pomembno vlogo pri virulenci mnogih patogenih mikroorganizmih. Pri E. coli je izražanje večje skupine pilus operonov uravnavano s Dam. Pri okužbi s Salmonella serovar Typhimurium je DNA adenin metilaza nujna pri razvoju tifiodne vročice. Pokazalo se je, da ima Dam pomembno vlogo pri patogenezi mnogih bakterij .
Pri večceličnih evkariontih je metilacija verjetno omejena samo na citozinske baze. Metilacija histonskih repov vpliva na strukturo histonskega jedra in s tem na regulacijo izražanja genov. Prav tako ne prihaja do prepisovanja genov, ki so metilirana. Samo jedro evkariontske celice vsebuje veliko količino DNA. Zato mora biti DNA »spakirana lepo«. Vsaka molekula DNA je spakirana v obliki kromosoma. Nukleoproteinski kompleks v jedru evkariontske celice se imenuje kromatin. Osnovne biokemijske sestavine kromatina so molekule DNA in dve vrsti beljakovin, histoni in nehistonski kromosomski proteini. Histoni so družina malih proteinov, ki imajo razmeroma veliko število pozitivno nabitih bazičnih aminokislinskih ostankov, arginina in lizina, ki se povezujejo z negativno nabitimi fosfatnimi skupinami v DNA.
Znanih je 5 vrst histonskih proteinov (H1, H2A, H2B, H3 in H4). Imajo različne molekulske mase in različna razmerja med argininom in lizinom. Nehistonski proteini se v jedru nahajajo v razmeroma malih količinah in so ali razni transkripcijski faktorji ali proteini, ki stabilizirajo multiproteinske komplekse. Da bi se genomska DNA lahko stisnila v dovolj majhen zvitek, ki bo imel prostor v celičnem jedru, mora biti molekula DNA natančno urejena in strnjena. Proces stiskanja se začne s sestavljanjem kompleksa DNA-histoni. Histonske sredice, ki imajo 8 beljakovinskih molekul (2 kopiji H2A, H2B, H3 in H4), so tesno ovite z DNA. Te komplekse imenujemo nukleosomi. Okoli sredice nukleosoma je ovitih točno 147/146 baznih parov. Vsak nukleosom se poveže še s histonom H1, ki dejansko omogoča povezovanje nukleosomov v 30nm fibrilo. Nukleosomi se nadalje stiskajo v solenoid (tuljava spominja na vlakna) s premerom 30nm. Ovijanje se nadaljuje tako, da nastajajo šopi zank in rozet, tako nastane kromatida. N terminalni konci lizina, ki štrlijo iz histonskih beljakovin so pomembni za regulacijo prepisovanja. Npr. z acetilacijo N terminalnega konca H4 histona se vlaknasta struktura solenoida razmakne in veriga postane bolj dostopna encimom, ki sodelujejo pri prepisovanju. Prav tako se lahko ti konci metilirajo, kar ohranja pozitiven naboj in preprečuje odpiranje solenoida Kornberg R. D. 1999. Eukaryotic transcriptional control. Trends in Genetics, 15, 12: 46-49 Tyler J. K. 2002. Chromatin assembly. Cooperation between histone chaperones and ATP-dependent nucleosome remodeling machines. European Journal of biochemistry, 269, 9: 2268-2274.
Metilacija histonskih repov vpliva na strukturo histonskega jedra in s tem na regulacijo izražanja genov. Prav tako metilacija DNA prepreči ekspresijo genov. Poznamo dva tipa metilacije DNA. Prva je »maintaince« metilacija, ki skrbi, da je tudi hčerinska DNA pri podvojevanju pravilno metilirana. Druga pa je de novo metilacija, ki povzroča metilacijo na popolnoma novih delih genoma. Pogosto je pri utišanju genov opažena interakcija med metilacijo DNA, histonskimi deacetilazami in kompleksi proteinov remodelacije Fuks F. 2005. DNA methylation and histone modifications: teaming up to silence genes. Current Opinion in Genetics & Development, 15, 5: 490-495. Saj sama DNA metilacija ni dovolj za popolno inaktivacijo gena. Poskusi kažejo, da metilacija DNA poskrbi predvsem za to, da ugasnjeni geni tudi ostanejo ugasnjeni. Metilacija DNA pa je potrebna tudi za »imprinting«. Ti označeni geni (imprinted genes) imajo metilirano DNA enega alela (prepisovanje gena poteka le z enega alela). Saj bi v nasprotnem primeru lahko prišlo do poškodbe organizma. Metilacija lahko povzroči, da se en gen prepisuje le z materinega kromosoma, drugi gen pa le z očetovega Bird A. 2002. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes and Development, 16, 1: 6-21.
Metilacija je del spomina celice. Po oploditvi se metilacijski vzorec prenese v zigoto, a se po petih dneh popolnoma izbriše in kasneje ponovno vzpostavi. Vzorec metilacije se med podvojevanjem DNA ohranja Cavalli G., Paro R. 1999. Epigenetic inheritance of active chromatin after removal of the main transactivator. Science, 286, 5441: 955-958. De novo metilacija poteka z encimom DNMT3a in DNMT3b. DNMT1 pa lahko metilira le komplementarno verigo Klose R. J., Bird A. P. 2006. Genomic DNA methylation: the mark and its mediators. TRENDS in Biochemical Sciences, 31, 2: 89-97. Med podvojevanjem nova nitka še ni metilirana, metilira se z zamikom. To je pomembno, saj v primeru napak lahko popravljalni mehanizmi prepoznajo novo nitko in jo popravijo še preden se metilira. Metilacija prav tako sodeluje pri utišanju genov na enem izmed dveh kromosomov X pri ženski Costello J. F., Plass C. 2001. Methylation matters. Journal of Medical genetics. 38, 5:285-303.
Da bi se določena mesta v genomu lahko prepisala oz. bila dostopna proteinom mora priti do premestitve nukleosomov oziroma spremembe strukture kromatina McQuibban G. A., Commisso-Cappelli C. N., Lewis P. N. 1998. Assembly, remodeling, and histone binding capabilities of yeast nucleosome assembly protein 1. Journal of Biological Chemistry, 273, 11: 6582-6590. Poznamo dva mehanizma.