Эпигено́мика () — раздел молекулярной биологии, изучающий совокупность эпигенетических модификаций генетического материала клетки () с помощью высокопроизводительных методов. Эпигеномика аналогична геномике и протеомике, которые изучают геном и протеом клетки, соответственно.
Эпигенетические модификации — это обратимые ковалентные химические модификации клеточной ДНК и гистонов, которые влияют на экспрессию генов, не изменяя нуклеотидную последовательность ДНК. Механизмы внесения ковалентных модификаций ДНК и гистонов и их влияния на экспрессию генов являются предметом изучения эпигенетики, а эпигеномика изучает результат — эпигенетические модификации и их распределение по геному при помощи молекулярных методов, таких как ChIP-seq, бисульфитное секвенирование и другие.
Самые изученные эпигенетические модификации — это метилирование ДНК и модификации гистонов. Изучение эпигенома на глобальном уровне стало возможно лишь относительно недавно в связи с развитием высокопроизводительных методов изучения генома.
Эпигенетические модификации
Модификации генома, которые изменяют экспрессию генов, но не связаны с изменением первичной последовательности ДНК (нуклеотидной последовательности) и передаются при митотическом и мейотическом делении клетки, называют эпигенетическими модификациями. Наиболее изучены такие эпигенетические модификации, как метилирование ДНК и модификации гистонов. Совокупность всех эпигенетических модификаций ДНК в клетке называют эпигеном. Клетка поддерживает свой эпигеном на протяжении всей жизни, поскольку стабильность эпигенома непосредственно связана со стабильностью генома, так как эпигеном вовлечён в важнейшие клеточные процессы, например, репарацию ДНК. Изменения эпигенома клетки могут привести к превращению её в злокачественную. Изменения эпигенома могут быть связаны с развитием и других заболеваний человека, помимо разных видов рака, таких как сахарный диабет 2-го типа, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, синдром ломкой X-хромосомы и синдром Прадера — Вилли.
Метилирование ДНК
Первой открытой эпигенетической модификацией стало метилирование ДНК. Метилирование ДНК заключается в присоединении метильной группы к нуклеотидам в составе ДНК. Ферменты, катализирующие эту реакцию, известны как ДНК-метилтрансферазы. Хотя метилирование ДНК — это стабильная и наследуемая модификация, существуют ферменты, удаляющие метильные метки с ДНК (). У эукариот метильная группа чаще всего присоединяется к пятому атому углерода азотистого основания цитозина в составе ДНК с образованием , или 5mC (как правило, в составе , в которых остатки цитозина соседствуют с остатками гуанина).
Нуклеотидные позиции, подвергающиеся метилированию, значительно различаются у разных видов и даже среди клеток одного организма. Животные используют метилирование ДНК по-разному; так, уровень метилирования ДНК у позвоночных очень высок, а у беспозвоночных он имеет средние значения. У некоторых организмов, таких как нематода Caenorhabditis elegans, 5mC и ДНК-метилтрансферазы полностью отсутствуют. Вероятно, в этих случаях роль метилирования ДНК выполняют иные механизмы.
В пределах одного организма уровень метилирования ДНК может значительно различаться на разных стадиях развития и в зависимости от участка генома. Например, у мыши примордиальные клетки зародышевой линии претерпевают полногеномное деметилирование, но на стадии имплантации зародыша метильные метки возвращаются на позиции, в которых они присутствовали у соматических клеток. Когда метилирование ДНК затрагивает промоторную область, то транскрипция соответствующего гена подавляется. Напротив, активно экспрессируемые гены, как правило, имеют неметилированные промоторы.
Механизм репрессии экспрессии генов через метилирование ДНК включает несколько этапов. С метилированными и неметилированными остатками цитозина взаимодействуют разные . Через них к участкам с 5mC привлекаются гистондеацетилазы, которые запускают ремоделирование хроматина, в результате которого ДНК становится недоступной для взаимодействия с компонентами аппарата транскрипции, такими как РНК-полимераза, что приводит к эффективной репрессии экспрессии генов.
Модификации гистонов
У эукариот геномная ДНК сопряжена с белками, образуя хроматин. Самые многочисленные белки хроматина — гистоны, на которые намотана двойная спираль ДНК. Гистоны обогащены положительно заряженными аминокислотами, что облегчает их связывание с отрицательно заряженным остовом ДНК за счёт электростатических взаимодействий. Основные повторяющиеся структурные единицы хроматина — нуклеосомы — представляют собой октамер, включающий по две молекулы коровых гистонов , , и , на который намотана нить ДНК длиной 146 пар оснований (п. о.). Нуклеосомы и намотанная на них ДНК формируют хроматиновую фибриллу диаметром 10 нм, которая может подвергаться дальнейшей конденсации.
Степень компактизации хроматина зависит от стадии клеточного цикла и может быть различной в разных участках генома. Степень конденсации хроматина связана с его транскрипционной активностью. Неконденсированный хроматин более транскрипционно-активен, чем плотно упакованный хроматин, так как он более доступен для аппарата транскрипции. Поэтому экспрессию гену можно модулировать за счёт ремоделирования хроматина и регулирования плотности его упаковки.
Ремоделирование хроматина осуществляется при помощи внесения посттрансляционных модификаций на N-концевые хвосты коровых гистонов. Совокупность модификаций гистонов в данной клетке называется . Известно множество видов модификаций гистонов: ацетилирование, метилирование, фосфорилирование, убиквитинилирование, SUMOилирование, АДФ-рибозилирование, дезаминирование и . Ацетилирование, метилирование, фосфорилирование и убиквитинилирование часто связаны с активацией экспрессии генов, а метилирование, убиквитинилирование, SUMOилирование, дезаминирование и изомеризация пролина могут приводить к репрессии гена. Стоит отметить, что некоторые модификации, такие как метилирование, фосфорилирование и убиквинитилирование могут влиять на транскрипционную активность генов в зависимости от специфических аминокислотных остатков модифицируемых геномов. Кроме того, свой вклад вносит и модифицируемый участок генома. Так, метилирование лизина 36 гистона H3 (H3K36me) в кодирующей области гена приводит к его активации, а в промоторе — напротив, к инактивации.
Модификации гистонов влияют на экспрессию генов при помощи двух основных механизмов: за счёт разрушения контактов между нуклеосомами и за счёт привлечения АТФаз, ремоделирующих хроматин. Первый механизм реализуется при ацетилировании остатков лизина на хвостах гистонов, которое катализируется гистонацетилтрансферазами. Гистонацетилтрансферазы входят в состав мультибелковых комплексов, которые привлекаются к хроматину при связывании с ДНК белков-активаторов. Ацетилирование нивелирует положительный заряд остатка лизина, который стабилизирует взаимодействие нуклеосом с отрицательно заряженным остовом ДНК. Ацетилированные остатки лизина в составе гистонов способствуют диссоциации нуклеосом и декомпактизации хроматина. В декомпактизованном хроматине ДНК более доступна для аппарата транскрипции, поэтому ген становится более активным. могут удалять ацетильные группы с хвостов гистонов.
Второй механизм включает привлечение комплексов ремоделирования хроматина через связывание белков-активаторов с соответствующими энхансерами. Комплексы ремоделирования хроматина меняют положение нуклеосом несколькими способами, что может как повышать, так и понижать доступность ДНК для аппарата транскрипции. Примером комплекса ремоделирования хроматина может служить комплекс дрожжей; он регулирует экспрессию нескольких генов через перестройки хроматина.
Методы Целью эпигеномики является поиск и описание эпигенетических меток на глобальном уровне, подобно тому, как геномика изучает всю совокупность генетического материала клетки, а протеомика — совокупность всех клеточных белков. Подобно геномике и протеомике, важнейшую методологическую часть эпигеномики составляют биоинформатические подходы.
Анализ модификаций гистонов Процессы транскрипции, репликации и репарации ДНК требуют взаимодействия геномной ДНК с ядерными белками. Известно, что некоторые участки генома особенно чувствительны к действию ДНКазы I, которая неспецифично расщепляет ДНК, не защищённую белками. Такие гиперчувствительные сайты считались транскрипционно активными участками генома, что подтвердилось их ассоциацией с РНК-полимеразой, а также топоизомеразами I и . В гиперчувствительных сайтах плотность упаковки ДНК понижена. Чаще всего гиперчувствительные сайты соответствуют промоторам, в которых ДНК должна быть открытой, чтобы с ней могли связаться компоненты аппарата транскрипции.
Полногеномный поиск эпигенетических модификаций впервые был выполнен с помощью метода () вместе с ДНК-микрочипами (эта технология известна как ). В случае ChIP-on-chip с помощью иммунопреципитации хроматина выделяют не транскрипционные факторы и ДНК-связывающие белки-активаторы, а модифицированные гистоны. Сначала гистоны in vivo ковалентно сшивают с ДНК при помощи обработки клеток формальдегидом. Далее клетки подвергают лизису, что делает возможным экстракцию и фрагментацию хроматина. Фрагментацию хроматина проводят с помощью обработки ультразвуком или эндонуклеазой рестрикции. В ходе такой обработки участки хроматина, не связанные с белками, разрушаются, так что остаются только комплексы ДНК с белками. Далее с помощью антител, специфичных к гистонам с определёнными модификациями, осуществляют иммунопреципитацию комплексов ДНК с такими гистонами. После иммунопреципитации ДНК и гистоны разделяют, фрагменты ДНК амплифицируют с помощью полимеразной цепной реакции и метят (например, или Cy5). На финальной стадии флуоресцентно-меченную ДНК гибридизуют с фрагментами геномной ДНК, иммобилизованными на ДНК-микрочипе. По интенсивности сигнала, соответствующего каждому фрагменту, делают вывод о том, с какими из них взаимодействуют гистоны с интересующей эпигенетической меткой.
С помощью ChIP-on-chip был изучен эпигеном пекарских дрожжей, на основании этого были сделаны выводы о функциях определённых модификаций гистонов. Было показано, с какими эпигенетическими метками связаны репрессия или активация транскрипции и в каких участках генома они происходят. Хотя с помощью ChIP-on-chip удалось изучить эпигеном дрожжей с почти полным покрытием, применение этого метода для организмов с более крупными геномами, таких как человек, ограничено.
Для полногеномного изучения эпигенетических меток на больших геномах вместе с иммунопреципитацией хроматина используют высокопрозводительные методы, такие как (от ), секвенирование спаренных концов (PET от ) и высокопроизводительное секвенирование (этот метод известен как ChIP-seq). ChIP-seq включает стандартный протокол иммунопреципитации хроматина, однако вместо амплификации выделенной ДНК и её гибридизации на микрочипе её секвенируют с помощью высокопроизводительных методов. ChIP-seq показал себя как эффективный метод для анализа модификаций гистонов на глобальном уровне, выявления сайтов связывания белков, взаимодействующих с ДНК, причём с большим разрешением, чем дают другие методы.
Анализ метилирования ДНК Методы определения нуклеотидной последовательности ДНК не подходят для обнаружения в ней метилированных нуклеотидов. В частности, при проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) или бактериального клонирования метильные метки не сохраняются при удвоении ДНК, и эпигенетическая информация теряется. Методы гибридизации ДНК, в которых для определения последовательности исследуемых фрагментов ДНК и их положения в геноме используются радиоактивные пробы, также не подходят, поскольку они не различают метилированную и неметилированную ДНК.