Хитиназы

Хитина́зы (КФ 3.2.1.14) — это ферменты, катализирующие деградацию хитина, действующие наиболее часто как эндоферменты, отщепляя хитоолигосахариды длиной в 2 — 6 N-ацетилглюкозаминовых остатков Stintzi A., Heitz T., Prasad V., Wiedemann-Merdinoglu S., Kauffmann S., Goeffroy P. et. al. Plant ‘pathogenesis-related’ proteins and their role in defense against pathogens. // Biochimie. — 1993. — V. 75. — p. 687—706. (полный текст статьи на англ. языке). Хитиназы относятся к группе О-гликозидных гидролаз, разрушающих гликозидную связь между двумя или более углеводными остатками или между углеводным и неуглеводным компонентом. Такие гидролазы объединены в семейства в зависимости от их аминокислотной последовательности. На данный момент известно 110 семейств этих ферментов , большинство хитиназ относится к семействам GH18 и GH19Theis T., Stahl U. Antifungal proteins: targets, mechanisms and prospective applications. // Cell. and Mol. Life Sciences. — 2004. — V. 61. — p. 437—455. (полный текст статьи на англ. языке), одна (принадлежащая насекомому отряда жесткокрылые Gastrophysa atrocyanea) — к семейству GH48. Их важнейшие свойства представлены в таблице 1.

Все организмы, содержащие хитин, продуцируют хитиназы, которые, вероятно, необходимы им для морфогенеза клеточной стенки или экзоскелета . Многие виды бактерий родов Bacillus, Pseudomonas и Streptomyces за счёт секреции хитиназ способны использовать хитин в качестве единственного источника углерода Wang S. L., Chang W. T. Purification and characterization of two bifunctional chitinase/lysozymes extracellulary produced by Pseudomonas aeruginosa K-187 in a shrimp and crab shell powder medium. // Appl. Environ. Microbiol. — 1997. — V. 63. — p. 380—386.Watanabe T., Kanai R., Kawase T., Tanabe T., Mitsutomi M., Sakuda S. et. al. Family 19 chitinases of Streptomyces species: characterization and distribution. // Microbiology. — 1999. — V. 145. — p. 3353-3363. (полный текст статьи на англ. языке)Wang S. L., Shih I. L., Liang T. W., Wang C. H. Purification and characterization of two antifungal chitinases produced by the Bacillus amyloliquefaciens V656 in a shrimp and crab shell powder medium. // J. Agric. Food Chem. — 2002. — V. 50. — p.2241-2248. (полный текст статьи на англ. языке). Кроме того, продукция хитиназ многими организмами является важным защитным фактором против воздействия различных патогенов. Хитиназы относятся к классу PR-3-белков . В соответствии с их аминокислотной последовательностью, PR-3 — белки, в свою очередь, подразделяются на четыре класса. Хитиназы класса I содержат хитин-связывающий гевеиноподобный домен и высококонсервативный центральный регион, отделённый от гевеинового домена шарнирным регионом. Хитиназы класса II сходны с таковыми класса I, но гевеиновый домен у них отсутствует. Хитиназы класса III не обнаруживают значимой гомологии с хитиназами иных классов. Хитиназы класса IV сходны с хитиназами класса I, но значительные области у ферментов данного класса отсутствуют.

+Таблица 1. Свойства хитиназ, входящих в семейства GH18, GH19 и GH48. Характеристики Хитиназы семейства GH18 Хитиназы семейства GH19 Хитиназа семейства GH48Fujita K., Shimomura K., Yamamoto K., Yamashita T., Suzuki K. A chitinase structurally related to the glycoside hydrolase family 48 is indispensable for the hormonally induced diapause termination in a beetle. // Biochem Biophys Res Commun. - 2006 Jun 23 - 345(1) - p. 502-507. Принадлежность семейства к клану гликозил-гидролаз GH-K близки к GH-I GH-M Распространение Хитиназы бактерий, грибов, вирусов, животных, хитиназы растений классов III и IV Хитиназы растений классов I, II и IV, хитиназы Streptomyces Хитиназа, принадлежащая насекомому отряда Жесткокрылые Gastrophysa atrocyanea Структура каталитического домена (β/α)8-бочонок Лизоцимовый тип (α+β)

(α/α)6 Гидролиз гликозидных связей С сохранением конформации Iseli B., Boller T., Neuhaus J. M. The N-terminal cysteine-rich domain of tobacco class I chitinase is essential for chitin binding but not for catalytic or antifungal activity. // Plant Physiol. – 1993. – V. 103 – p. 221–226. C инверсией конформации Ohno T., Armand S., Hata T., Nikaidou N., Henrissat B., Mitsutomi M. et. al. A modular family 19 chitinase found in the prokaryotic organism Streptomyces griseus HUT 6. // J. Bacteriology. – 1996. – V. 178. – p. 5065–5070. (полный текст статьи на англ. языке) C инверсией конформации Разрываемая связь GlcNAc-GlcNAc и GlcNAc-GlcN GlcNAc-GlcNAc и GlcN-GlcNAc Mitsutomi M., Ueda M., Arai M., Ando A., Watanabe T. Action patterns of microbial chitinases on partially N-acetylated chitosan. // Chitin Enzymol. – 1996. – V.2. – p. 273–284. — Чувствительность к ингибиторам Чувствительны к аллозамидину Koga D., Isogai A., Sakuda S., Matsumoto S., Suzuki A., Kimura S. Specific inhibition of Bombyx mori chitinase by allosamidin. // Agric. Biol. Chem. – 1987. – V. 51. – p. 471–476. Нечувствительны к аллозамидину —

Классификация углеводсвязывающих участков Важную роль в классификации хитиназ и хитинолитических комплексов играют так называемые хитинсвязывающие домены (ChBDs — chitin-binding domains), принадлежащие к различным семействам углеводсвязывающих участков CBM (carbohydrate-binding modules). Среди семейств, содержащих в своем составе хитинсвязывающие домены, можно выделить 4 основных: CBM12, CBM14, CBM18, CBM19 (см. таблицу 2).

CBM выполняют роль связывания с различными полисахаридными субстратами, зачастую нерастворимыми в воде. CBM-кодирующие последовательности могут находиться как в составе гена хитиназы, так и иметь собственную ORF, продуктом которой является соответствующий углеводсвязывающий белокHenrissat B., Bairoch A. New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similaries. // Biochem. J. — 1993—293 — p. 781—788..

+Таблица 2. Характеристика семейств CBM, выполняющих хитинсвязывающую функцию. Семейство CBM Количество аминокислотных остатков Структура Распространение Примечания CBM1 ~40 Цистеиновый узел Принадлежащая III классу хитиназа Cht1 микромицета Hypocrea virens CBM2 ~100 β-сэндвич В составе бактериальных ферментов CBM5 ~60 Уникальная В составе бактериальных ферментов CBM12 40-60 Уникальная В составе бактериальных ферментов. Большинство модулей семейства принадлежит к хитинсвязывающим CBM14 ~70 Уникальная, содержит гевеин-подобную последовательность Гидроидные полипы, нематоды, ракообразные, паукообразные, насекомые, головохордовые, костные рыбы, мышь, человек В составе семейства многочисленны хитинсвязывающие домены. Найдены модули, как присоединенные к каталитическому хитиназному домену, так и те, которые находятся в составе белков без каталитической функции, в изолированном состоянии (1 CBM представляет собой отдельный белок) либо в составе многократных повторов CBM18 ~40 Гевеиновая последовательность Растения, грибы Большинство модулей семейства принадлежит к хитинсвязывающим. Найдены модули, как присоединенные к каталитическому хитиназному домену, так и те, которые находятся в составе белков без каталитической функции, в изолированном состоянии (1 CBM представляет собой отдельный белок) либо в составе многократных повторов CBM19 60-70 — Грибы (в том числе дрожжи Saccharomyces cerevisiae) Для модулей семейства характерна только хитинсвязывающая функция CBM33 — — Хитинсвязывающий белок бактерии Serratia marcescens

CBM37 ~100 — Ферменты бактерии Ruminococcus albus Хитинсвязывающая функция не является основной

Расщепление хитина хитиназами in vivo в бактериях В процессе деградации хитина бактериями задействовано несколько ферментов, образующих хитинолитический комплекс. Деполимеразы расщепляют хитин до хитоолигосахаридов, N-ацетилглюкозамина и хитобиозы; в результате работы деацетилаз образуется хитозан. Хитоолигосахариды затем транспортируются в периплазматическое пространство, возможно, через специфические порины наружной мембраны, где расщепляются до N-ацетилглюкозамина хитодекстриназами. Хитобиоза, проникающая в периплазматическое пространство через неспецифические порины, частично расщепляется до N-ацетилглюкозамина периплазматическими N-ацетилглюкозаминидазами, частично транспортируется в цитоплазму клетки, где расщепляется цитоплазматическими N-ацетилглюкозаминидазами, формируя дополнительное количество N-ацетилглюкозамина. В свою очередь, N-ацетилглюкозамин последовательно переносится в цитоплазму и вовлекается в метаболизм клеткиHoward M. B., Ekborg N. A., Weiner R.M., Hutcheson S. W. Detection and characterization of chitinases and other chitin-modifying enzymes. // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. — 2003. — V. 30. — p. 627—635. (полный текст статьи на англ. языке).

Физиологическая роль хитиназ Наличие хитиназ выявлено у огромного числа живых организмов. Многие из них, например, насекомые, ракообразные или грибы, содержат хитин; другие — бактерии, высшие растения, позвоночные — хитина не содержат.

Все организмы, содержащие хитин, продуцируют хитиназы, которые, вероятно, необходимы им для морфогенеза клеточной стенки или экзоскелета. Многие виды бактерий родов Bacillus, Pseudomonas и Streptomyces за счёт секреции хитиназ способны использовать хитин в качестве единственного источника углерода. Кроме того, продукция хитиназ многими организмами является важным защитным фактором против воздействия различных патогенов.

У членистоногих хитиназы принимают участие в процессах линьки и пищеварения. Продукты гидролиза хитина, как правило, вовлекаются в синтез новой кутикулыKramer K. J., Muthukrishnan S., Lowell J., White F. Chitinases for insect control. — In: Advances in insect control. / Eds. N. Carozzi, M. Koziel. Taylor and Francis, Bristol, 1997, p. 185—193.. Модель роста клеточной стенки грибов, предложенная Bartnicki-Garcia (1973) Bartnicki-Garcia S. Fundamental aspects of hyphal morphogenesis. — In: Microbial differentiation. / Eds. Ashworth J. M., Smith J. E. Cambridge University Press, London, 1973, p. 245—267., предусматривает определённую роль литических ферментов в поддержании баланса между синтезом и лизисом клеточной стенки во время апикального роста мицелия. Доказательство совместной работы хитиназ и хитинсинтаз были получены в результате обнаружения активности этих ферментов в процессах прорастания спор у Mucor mucedo Gooday G. W., Humphreys A. M., McIntosh W. I. I. Roles of chitinases in fungal growth. — In: Chitin in nature and technology. / Eds. Muzzarelli R. A. A., Jeuniaux C., Gooday G. W. Plenum Press, New York, 1986, p. 83 — 91., экспоненциального роста у Mucor rouxii Rast D. M., Horsch M., Furter R., Gooday G. W. A complex chitinolytic system in exponentially growing mycelium of Mucor rouxii properties and function. // J. Gen. Microbiol. — 1991. — V. 2797—2810. (полный текст статьи на англ. языке) и Candida albicansBarret-Bee K., Hamilton M. The detection and analyses of chitinase activity from the yeast form of Candida albicans. // J. Gen. Microbiol. — 1984. — V. 130. — p. 1857—1861., а также в результате обнаружения как хитиназной, так и хитинсинтазной активности в одной и той же фракции, выделенной из клеточной стенки M. mucedo Humphreys A. M., Gooday G. W. Properties of chitinase activities from Mucor mucedo: evidence for membrane-bound zymogenic form. // J. Gen. Microbiol. — 1984. — V. 130. — p. 1359—1366.. Sahai и соавт. (1993) Sahai A. S., Manocha M. S. Chitinases of fungi and plants: their involvement in morphogenesis and host-parasite interaction. // FEMS Microb. Reviews. — 1993. — V. 11. — p. 317—338. показали, что хитиназы присутствуют при набухании и прорастании спор, формировании спорангия, а также при механических повреждениях у Choanephora cucurbitarum и других зигомицетов.