Гомологичная рекомбинация

Гомологи́чная рекомбина́ция, или о́бщая рекомбина́ция, — тип генетической рекомбинации, во время которой происходит обмен нуклеотидными последовательностями между двумя похожими или идентичными хромосомами. Это наиболее широко используемый клетками способ устранения двух- или однонитевых повреждений ДНК. Гомологичная рекомбинация также создаёт разнообразие комбинаций генов во время мейоза, обеспечивающих высокий уровень наследственной изменчивости, что, в свою очередь, позволяет популяции лучше адаптироваться в ходе эволюции. Различные штаммы и виды бактерий и вирусов используют гомологичную рекомбинацию в процессе горизонтального переноса генов.

Хотя механизм гомологичной рекомбинации (ГР) широко варьируется среди разных организмов и типов клеток, зачастую в её основе лежит один и тот же механизм. Разрыв двух нитей ДНК приводит к тому, что 5'-концы непосредственно рядом с повреждением удаляются. Следующий шаг заключается во внедрении или инвазии 3'-конца повреждённой цепи в другую, целую ДНК, используемую в качестве матрицы. Дальнейшая последовательность событий может идти двумя путями (описанными ниже), известными как DSBR или SDSA. Гомологическая рекомбинация, происходящая во время репарации ДНК, как правило, приводит к восстановлению молекулы в том же виде, в котором та находилась до повреждения.

Поскольку явление ГР прослеживается во всех трёх доменах живой природы, а также у вирусов, его можно считать универсальным биологическим механизмом. Открытие ГР-генов у протистов — разнообразной группы эукариотических микроорганизмов — было истолковано как свидетельство того, что мейоз возник на раннем этапе эволюции эукариот. Так как нарушение работы этих генов часто связана с возникновением нескольких видов рака, белки, кодируемые этими генами и участвующие в процессе ГР, являются предметом активных исследований. На гомологической рекомбинации построен также  — процесс, при котором в геном организма вносятся искусственные изменения. За развитие этой технологии Марио Капекки, Мартин Эванс и Оливер Смитис были удостоены в 2007 году Нобелевской премии по физиологии и медицине. Капекки и Смитис независимо друг от друга открыли способ редактирования геномов эмбриональных стволовых клеток мышей, однако, высококонсервативные механизмы, лежащие в основе репарации повреждений ДНК, в том числе вставки изменённой последовательности гена при генной терапии, были впервые изучены в экспериментах с плазмидами, проведённых Терри Орр-Вивер, Джеком Шостаком и Родни Ротштейном. Исследование плазмид, облучённых γ-излучением, привело к экспериментам, в ходе которых при помощи эндонуклеаз разрезались хромосомы для нужд генной инженерии клеток млекопитающих, где негомологичная рекомбинация встречается чаще, чем у дрожжей.

История изучения

В начале 1900-х годов Уильям Бейтсон и Реджинальд Паннет нашли исключение из одного из законов Менделя, первоначально описанных Грегором Менделем в 1860-х годах. В отличие от идеи Менделя о том, что признаки наследуются независимо друг от друга при передаче их потомству, Бейтсон и Паннет показали, что некоторые гены, связанные с физическими признаками, могут быть унаследованы вместе, или генетически связаны. В 1911 году, когда выяснилось, что связанные черты могут иногда передаваться отдельно, Томас Хант Морган предположил, что между связанными генами происходит кроссинговер, во время которого один из сцепленных генов физически переходит на другую хромосому. Двадцать лет спустя Барбара Мак-Клинток и Харриет Крейтон доказали, что обмен участками хромосом происходит при мейозе, обычно связанном с образованием гамет. В тот же год, когда было совершено открытие Мак-Клинток, Курт Штерн показал, что кроссинговер может также происходить в соматических клетках, таких как лейкоциты и клетки кожи, которые делятся митозом.

В 1947 году микробиолог Джошуа Ледерберг продемонстрировал, что бактерии, которые, как предполагалось, размножаются только путём бинарного деления, обладают способностью к генетической рекомбинации, которая больше напоминает половое размножение. Эта работа основывалась на исследовании кишечной палочки Escherichia coli, и за неё Ледерберг был удостоен Нобелевской премии по физиологии и медицине в 1958 году. В 1964 году, опираясь на исследования грибов, Робин Холлидей предложил модель рекомбинации в мейозе, которая включала в себя все ключевые аспекты этого процесса, в том числе обмен генетическим материалом между хромосомами посредством образования структуры Холлидея. В 1983 году Джек Шостак и его коллеги представили другую модель, известную сейчас как путь репарации двуцепочечных разрывов (), толковавшую те детали, которые не смогла объяснить модель Холлидея. В течение следующих десяти лет в результате экспериментов на дрозофилах, дрожжах и клетках млекопитающих был обнаружен ещё один тип гомологической рекомбинации, не всегда следующий модели Холлидея, который был назван путём синтез-зависимого отжига цепей ().

У эукариот Гомологичная рекомбинация имеет важное значение в делении клеток эукариот: растений, животных, грибов и протистов. В клетках, делящихся путём митоза, ГР является инструментом репарации повреждений ДНК, вызванных ионизирующим излучением или химическими веществами. Будучи неотрепарированными, эти повреждения способны привести к масштабной перестройке хромосом в соматических клетках, а потом и к раку.

В дополнение к устранению повреждений, ГР обеспечивает генетическое разнообразие при мейотическом делении с последующим образованием гамет и спор. Центральную роль здесь играет кроссинговер, в результате которого хромосомы обмениваются участками ДНК. Благодаря этому появляются новые, возможно, полезные комбинации генов, которые могут дать потомству эволюционное преимущество. Чаще всего кроссинговер начинается, когда белок делает целевые двойные разрезы в цепи ДНК строго определённым образом, преимущественно в промоторах и GC-обогащённых областях. Обычно эти области находятся в так называемых горячих точках рекомбинации — участках, состоящих из приблизительно 1000—2000 пар оснований и имеющих высокую частоту рекомбинации. Отсутствие горячих точек рядом с двумя генами в одной и той же хромосоме часто означает, что эти гены будут унаследованы будущими поколениями в равной пропорции.

Регуляция

Двойные разрывы ДНК-цепи могут быть исправлены либо путём гомологичной рекомбинации, либо негомологичным соединением концов (НСК, ). НСК (NHEJ) — механизм репарации, который, в отличие от ГР, не требует гомологичной матрицы. Выбор одного из этих двух механизмов репарации во многом определяется фазой клеточного цикла. ГР возможна во время S-фазы и G2-стадии клеточного цикла, когда в качестве неповреждённой гомологичной матрицы используются сестринские хроматиды. В сравнении с гомологичными хромосомами, которые несут одни и те же гены, но разные аллели, сестринские хромосомы полностью идентичны друг другу и являются идеальными матрицами для рекомбинации. В свою очередь, НСК происходит во время G1-фазы клеточного цикла, когда клетка растёт, но хромосомы ещё не редуплицированы. Вне G1-фазы частота НСК намного меньше, однако его вероятность сохраняется на протяжении всего клеточного цикла. Механизмы, регулирующие и ГР, и НСК на протяжении всего цикла, варьируют в широких пределах у разных видов.

Циклинзависимые киназы (cdk), меняющие активность других белков при помощи фосфорилирования, играют важную роль в регуляции процесса ГР у эукариот. У почкующихся дрожжей, когда начинается репликация ДНК, циклинзависимые киназы запускают ГР путём фосфорилирования белка . Активированный таким образом Sae2 использует эндонуклеазы чтобы сделать точный двуцепочечный разрез в ДНК, после чего трёхкомпонентный гетеродимерный белок MRX связывается с ДНК и начинает белок-управляемую реакцию по обмену генетическим материалом между двумя молекулами ДНК.

Запуск пути НСК (NHEJ) начинается с привлечения к области повреждения белка , который способствует дальнейшей репарации двуцепочечного разрыва по пути NHEJ. До момента подрезания концов возможно переключение на гомологичную рекомбинацию, которое достигается путём привлечения к повреждённой области белка-антагониста 53BP1 — BRCA1. Если BRCA1 вытесняет 53BP1, то двуцепочечный разрыв будет восстановлен по пути гомологичной рекомбинации. Помимо 53BP1 и BRCA1, в выборе пути для устранения двуцепочечного разрыва задействованы белки и CtIP — нуклеаза, задействованная в подрезании концов на первых этапах гомологичной рекомбинации. Таким образом, 53BP1 и RIF1 направляют восстановление по пути негомологичного соединения концов, а BRCA1 и CtIP — по пути гомологичной рекомбинации.

Гомологичная рекомбинация для восстановления двуцепочечных разрывов может быть использована только в S- и G2-фазах, когда в результате удвоения ДНК появляется матрица для репарации (поэтому NHEJ, активный во время всего клеточного цикла, является основным механизмом восстановления двуцепочечных разрывов в клетках млекопитающих). Исключение составляют области генома, содержащие повторы, например, повторы генов, кодирующих рРНК (рДНК). В рДНК матрица для восстановления двуцепочечного разрыва в повторе имеется в течение всего клеточного цикла, ею может выступать любой другой повтор. В случае рДНК мелкие повреждения быстро устраняются NHEJ внутри ядрышка (время протекания NHEJ составляет около 30 минут, а гомологичной рекомбинации — примерно 7 часов), а крупные и сложные повреждения перемещаются вместе с белками фибриллярных центров и плотного фибриллярного компонента на периферию, образуя так называемый ядрышковый кэп. В ядрышковом кэпе происходят все, кроме самых первых, этапы гомологичной рекомбинации, при этом повторы рДНК сближаются, что способствует рекомбинации. В ядрышковых кэпах NHEJ не происходит. На выбор пути восстановления двуцепочечного разрыва также влияет сложность повреждения. NHEJ, как правило, используется для устранения небольших повреждений.

Модели Известно два основных механизма гомологичной рекомбинации: путь репарации двуцепочечных разрывов (DSBR-путь), также известный как модель двойной структуры Холлидея, и путь синтезозависимого отжига цепи (SDSA-путь). Оба начинаются одинаковым образом. Когда двуцепочечный разрыв в цепи обнаружен, белковый комплекс MRX (у человека MRN) встает по обе стороны от разрыва, после чего следует отрезание 5'-концов, проходящее в два отдельных этапа. Первый этап заключается в том, что MRX в паре с белком Sae2 вырезают 5'-концы цепи около разрыва, тем самым оставляя выступающие 3'-концы. Второй этап 5' → 3'-отрезания продолжает геликаза и нуклеазы и . Sgs1 «расстёгивает» двойную спираль, а Exo1 и Dna2 создают разрывы в одноцепочечной ДНК, высвобожденной Sgs1.

Репликативный белок А (RPA), имеющий высокое сродство к одноцепочечной ДНК, связывает выступающие 3'-концы и с помощью ряда других белков, которые опосредуют процесс, например (и в мейозе), формирует комплекс с одноцепочечной ДНК, покрывая её. Затем нуклеопротеидная нить ищет похожую или идентичную цепь ДНК и внедряется в неё, когда находит. В клетках, делящихся путём митоза, «жертвой» внедрения (реципиентным ДНК-дуплексом) обычно является сестринская хроматида, идентичная повреждённой ДНК, которая чаще всего используется в качестве матрицы для репарации. В мейозе, однако, реципиентным ДНК-дуплексом служит гомологичная хромосома, которая очень похожа на повреждённую хромосому, но не обязательно идентична ей.

В ходе вторжения цепи между торчащим 3'-концом внедряющейся цепи и гомологичной хромосомой образуется . После этого ДНК-полимераза продлевает 3'-концы. Получившаяся перекрёстная структура называется структурой Холлидея. Вслед за этим на внедрённой цепи (то есть на одном из выступающих 3'-концов) происходит синтез ДНК, эффективно восстанавливая её комплементарно гомологичной хромосоме в том месте, откуда была вытеснена D-петля.

Репарация двуцепочечных разрывов