мини|782x782пкс| Дијаграм на молекуларно клонирање со користење на бактерии и плазмиди.
Молекуларно клонирање ― збир на опитни методи во молекуларната биологија кои се користени за склопување на рекомбинантни молекули на ДНК и за насочување на нивната репликација во организмите домаќини. Употребата на зборот клонирање се однесува на фактот дека методот вклучува репликација на една молекула за да створи население на клетки со идентични молекули на ДНК. Молекуларното клонирање претежно користи низи на ДНК од два различни организми: видот кој е извор на ДНК што треба да биде клониран и видот што ќе служи како жив домаќин за репликација на рекомбинантната ДНК. Методите на молекуларно клонирање се главни појави за многу современи области на современата биологија и медицина.
Во конвенционален опит за молекуларно клонирање, ДНК што треба да биде клонирана се добива од организам од интерес, а потоа е третирана со ензими во епрувета за да бидат создадени помали фрагменти на ДНК. Последователно, овие фрагменти потоа се комбинирани со векторска ДНК за да создаваат рекомбинантни молекули на ДНК. Рекомбинантната ДНК потоа е внесувана во организмот домаќин (обично лесен за растење, бениген, лабораториски врста на бактерија E. coli). Ова ќе створи население на организми во кои рекомбинантните молекули на ДНК се реплицираат заедно со ДНК-та на домаќинот. Бидејќи тие содржат туѓи фрагменти на ДНК, тоа се трансгенски или генетски изменет микроорганизам. Оваа постапка го користи фактот дека една бактериска клетка може да биде индуцирана да зафаќа и реплицира една единствена рекомбинантна молекула на ДНК. Оваа единствена клетка потоа може да се прошири експоненцијално за да создава голем број бактерии, од кои секоја содржи копии од првобитната рекомбинантна молекула. Така, и настанатото бактериско население, и рекомбинантната молекула ДНК, најчесто се нарекувани „клонови“. Строго кажано, „рекомбинантната ДНК“ се однесува на молекулите на ДНК, додека „молекуларното клонирање“ се однесува на опитните методи што се користени за нивно склопување. Била појавена идејата дека различни низи на ДНК може да бидат вметнати во плазмид и дека овие туѓи низи ќе се носени во бактерии и ќе се вари како дел од плазмидот. Односно, овие плазмиди би можеле да послужат како вектори за клонирање за да носат гени.
Практично секоја низа на ДНК може да биде клонирана и засилена, но има некои фактори кои може да го ограничат успехот на постапката. Примери на низи на ДНК кои тешко се клонирани се превртените повторувања, потеклото на репликацијата, центромерите и теломерите. Исто така, има помали шанси за успех кога се вметнувани низи на ДНК со големи димензии. Вметнувањата поголеми од 10 kbp имаат многу ограничен успех, но бактериофагите како бактериофагот λ може да бидат изменети за успешно да вметнат низа до 40 kbp.
Историја Пред 1970-тите, разбирањето на генетиката и молекуларната биологија било сериозно попречено од неможноста да бидат изолирани и проучувани поединечни гени од сложени организми. Ова драматично било променето со доаѓањето на методите на молекуларно клонирање. Микробиолозите, барајќи да ги разберат молекуларните механизми преку кои бактериите го ограничуваат растот на бактериофагите, изолирале рестрикциони ендонуклеази, ензими кои можат да ги расцепат молекулите на ДНК само кога ќе се сретнат специфични низи на ДНК. Тие покажале дека рестрикционите ензими ги расцепуваат молекулите на ДНК со должина на хромозомот на одредени места и дека специфичните делови од поголемата молекула може да бидат прочистени со расцепкување на големината. Со користење на втор ензим, ДНК-лигаза, фрагменти создавани од рестрикциони ензими може да бидат споени во нови комбинации, наречени рекомбинантна ДНК. Со рекомбинирање на ДНК сегменти од интерес со векторска ДНК, како што се бактериофаги или плазмиди, кои природно се реплицираат во бактериите, може да бидат направени големи количини на прочистени рекомбинантни ДНК молекули во бактериски култури. Првите рекомбинантни молекули на ДНК биле создадени и проучувани во 1972 година.
Преглед Молекуларното клонирање го користи фактот дека хемиската структура на ДНК е фундаментално иста кај сите живи организми. Затоа, ако некој сегмент од ДНК од кој било организам е вметнат во сегмент на ДНК кој ги содржи молекуларните низи потребни за репликација на ДНК, а добиената рекомбинантна ДНК е внесена во организмот од кој се добиени низите за репликација, тогаш туѓата ДНК ќе се реплицира заедно со ДНК на клетката домаќин во трансгенскиот организам.
Молекуларното клонирање е слично на полимеразната верижна реакција по тоа што дозволува репликација на низата на ДНК. Основната разлика помеѓу двата методи е што молекуларното клонирање вклучува репликација на ДНК во жив микроорганизам, додека полимеразната верижна реакција реплицира ДНК во ин витро раствор, без живи клетки.
Дигитално клонирање и симулации Пред да бидат извршени вистински опити за клонирање во лабораторија, повеќето опити за клонирање биле планирани на сметач, користејќи специјализиран софтвер. Иако подробното планирање на клонирањето може да биде направено во кој било уредувач на текст, заедно со семрежни алатки за на пр. дизајн на зачетник со полимеразната верижна реакција, постои посебен софтвер за таа цел. Софтверот за таа цел вклучува на пример ApE (отворен код), DNAStrider (отворен код), Serial Cloner (бесплатен), Collagene (отворен код) и SnapGene (комерцијален). Овие програми овозможуваат симулирање на полимеразните верижни реакции, рестрикциони дигести, лигации итн., односно сите чекори опишани подолу.
Чекори мини|Општата цел на молекуларното клонирање е да биде земен ген од интерес од еден плазмид и да биде вметнат во друг плазмид. Ова се прави со изведување на полимеразната верижна реакција, дигестивна реакција, реакција на лигатура и преобразба. Во стандардните молекуларни опити за клонирање, клонирањето на кој било фрагмент на ДНК суштински вклучува седум чекори: (1) Избор на организам домаќин и вектор за клонирање, (2) Подготовка на векторска ДНК, (3) Подготовка на ДНК што треба да биде клонирана, (4) создавање на рекомбинантна ДНК, (5) Воведување на рекомбинантна ДНК во организмот домаќин, (6) Избор на организми кои содржат рекомбинантна ДНК, (7) Преглед за клонови со сакани внесови на ДНК и биолошки својства.
Имено, растечкиот капацитет и верноста на платформите за синтеза на ДНК овозможуваат сè посложени дизајни во молекуларното инженерство. Овие проекти може да вклучуваат многу долги нишки од нова низа на ДНК и/или да тестираат цели библиотеки истовремено, за разлика од поединечните низи. Овие промени воведуваат сложеност што бара дизајнот да биде оддалечено од рамната претстава заснована на нуклеотид и кон повисоко ниво на апстракција. Примери за такви алатки се GenoCAD, Teselagen (бесплатно за академските кругови) или GeneticConstructor (бесплатно за академици).
Избор на организам домаќин и вектор за клонирање мини|250x250пкс| Дијаграм на најчесто користен плазмид за клонирање; pBR322 . Тоа е кружно парче ДНК долга 4361 бази. Присутни се два гена за отпорност на антибиотици, кои даваат отпорност на ампицилин и тетрациклин, и потекло на репликација што домаќинот го користи за реплицирање на ДНК. Иако се користени многу голем број на организми домаќини и вектори за молекуларно клонирање, поголемиот дел од опитите за молекуларно клонирање започнуваат со лабораториска врста на бактеријата Escherichia coli и плазмиден вектор за клонирање. E. coli и плазмидните вектори се во вообичаена употреба бидејќи се технички софистицирани, разновидни, широко достапни и нудат брз раст на рекомбинантните организми со минимална опрема. Ако ДНК што треба да биде клонирана е исклучително голема (од стотици илјади до милиони базни парови), тогаш често е избиран бактериски вештачки хромозом или вектор на вештачки хромозом од квасец.
Специјализираните примени може да бараат специјализирани системи за домаќин-вектор. На пример, ако испитувачите сакаат да соберат одредена белковина од рекомбинантниот организам, тогаш е избиран изразувачки вектор кој содржи соодветни сигнали за транскрипција и превод во посакуваниот организам домаќин. Алтернативно, ако е сакана репликација на ДНК во различни видови (на пример, пренос на ДНК од бактерии на растенија), тогаш може да биде избран вектор на повеќекратен опсег на домаќин (исто така наречен двофункционален вектор). Меѓутоа, во пракса, засебните опити за молекуларно клонирање обично започнуваат со клонирање во бактериски плазмид, проследено со потклонирање во засебен вектор.
Без оглед на комбинацијата на домаќин и вектор, векторот речиси секогаш содржи четири сегменти на ДНК кои се критично важни за неговата функција и опитна корист:
Потеклото на репликација на ДНК е неопходно за векторот (и неговите поврзани рекомбинантни низи) да се реплицираат во организмот домаќин едно или повеќе уникатни места за препознавање на рестрикциона ендонуклеаза да служат како места каде што може да биде воведена туѓа ДНК може да биде избран генетски маркер што може да биде користен за да биде овозможено преживување на клетките кои зафатиле векторски низи ген за ознака што може да биде користени за преглед на клетки кои содржат туѓа ДНК
лево|мини|250x250пкс| Расцепување на низа на ДНК што го содржи местото на ограничување BamHI. ДНК се расцепува на палиндромската низа за да бидат создадени „лепливи краеви“.
Подготовка на векторска ДНК Векторот за клонирање е третиран со рестрикциона ендонуклеаза за да биде расцепена ДНК на местото каде што ќе биде вметната туѓа ДНК. Рестрикциониот ензим е избран да создаде конфигурација на местото на расцепување што е соодветно со краевите на туѓата ДНК (види крај на ДНК). Вообичаено, ова се прави со расцепување на векторската ДНК и туѓа ДНК со истиот рестрикционен ензим или рестрикциона ендонуклеаза, на пример EcoRI и овој рестрикционен ензим бил изолиран од E.coli. Повеќето современи вектори содржат разновидни погодни места за расцепување кои се единствени во рамките на векторската молекула (така што векторот може да се расцепи само на едно место) и се сместени во рамките на генот (често бета-галактозидаза) чие исклучување може да биде користено за да бидат разликувани рекомбинантните од нерекомбинантните организми на подоцнежен чекор во постапката. За да биде подобрен односот на рекомбинантните и нерекомбинантните организми, расцепениот вектор може да биде третиран со ензим (алкална фосфатаза) кој ги дефосфорилира краевите на векторот. Векторските молекули со дефосфорилирани краеви не се способни да се реплицираат, а репликацијата може да биде обновена само ако туѓа ДНК е вметната во местото на расцепување.
Подготовка на ДНК за клонирање мини| ДНК за клонирање најчесто се правена со помош на полимеразна верижна реакција. Шаблонска ДНК е мешана со бази (градежните блокови на ДНК), зачетници (кратки парчиња комплементарна едноверижна ДНК) и ензим ДНК- полимераза што го гради ланецот на ДНК. Мешавината поминува низ циклуси на загревање и ладење за да произведе големи количини на копирана ДНК. За клонирање на геномската ДНК, ДНК што треба да биде клонирана, е екстрахирана од организмот од интерес. Практично секој извор на ткиво може да биде користен (дури и ткива од изумрени животни, сè додека ДНК не е интензивно разградена. ДНК потоа е прочистувана со помош на едноставни методи за отстранување на контаминирачките белковини (екстракција со фенол), РНК (рибонуклеаза) и помали молекули (таложење и/или хроматографија). Методите со полимеразна верижна реакција често се користени за амплификација на специфични низи на ДНК или РНК (обратна транскрипција-полимеразна верижна реакција) пред молекуларното клонирање.