膜電位感受性色素 (voltage-sensitive dye) voltage-sensitive dyeの日本語訳としては、膜電位プローブや電位感受性色素をはじめとして様々な用語が用いられてきたが、生体膜の膜電位をモニターするための色素であることを強調するための「膜」という文字がつけられた「膜電位感受性色素」が当初より用いられた正式な用語である。は、光学的に膜電位変化を計測するための色素の総称である。膜電位イメージングに用いられる化学小分子型(organic)の分子を指す。
イェール大学の Larry Cohen教授のグループ（Larry Cohen (Yale Univ, USA), Brian Salzberg (Univ Penn, USA), Amiram Grinvald (Weizmann Inst, Israel), Bill Ross (NY Med Coll, USA), Kohtaro Kamino (Tokyo Med Dent Univ, Japan)）によって開発された。この色素を用いれば、生体標本上の多数の領域から膜電位変化を計測できる。
日本においては、開発者のひとりである東京医科歯科大学の神野耕太郎名誉教授が初めて導入し、自前でフォトダイオード(1ch)、light guide方式(16 ch)、フォトダイオードアレイ(10x10 ch, 12x12 ch, 34x34 ch)を用いた測定機器を開発・改良して測定を開始したことに始まる。当初は、心臓や神経系の機能発生・機能形成の研究に応用され、その後、測定システムが市販されたことにより、一般に用いられるようになっている。開発初期の歴史や測定システムの原理に関しては、以下の文献に詳しく解説されている。 神野耕太郎「ニューロン活動の光学的測定の背景と展開」神経科学レビュー 5: 155-187, 1991. 神野耕太郎、佐藤容子、佐藤勝重、持田啓「膜電位感受性色素をもちいた計測と解析法」日本生理学雑誌 61: 95-134, 1999． Kamino, K. (2015) Personal recollections: Regarding the pioneer days of optical recording of membrane potential using voltage-sensitive dyes. Neurophotonics 2, 021002.
また、以下の英語本に歴史から最新の研究まで詳しく紹介されている。 Membrane Potential Imaging in the Nervous System and Heart. Eds. Canepari, M., Zecevic, D and Bernus, O. Springer-Verlag, New York, 2015.
Larry Cohen教授の功績に関しては、Neurophotonics誌（April 2015 | Volume 2, Issue 2）に、"Pioneers in Neurophotonics: Special Section Honoring Professor Lawrence B. Cohen"と題して特集が組まれているhttp://neurophotonics.spiedigitallibrary.org/Issue.aspx?JournalID=169&issueID=931888&direction=P。
歴史 B. C. 的背景 生物学、医学における光学的観察あるいは光学的測定の歴史は古いが、神経系の研究へもかなり早くから導入されている。 ・1848年にはすでに F. Ehrenbergが神経線維に2つの異なった屈折率があることを見いだしたことを Francis O. Schmitt (1939) が Physiological Reviews誌に発表した総説に引用しているSchmitt FO : The ultrastructure of protoplasmic constituents. Physiol Rev 19 : 270-302, 1939。 ・さらに、1865年には、Klebsが神経線維のミエリン鞘の偏光性についての論文を発表している。 ・この線に沿った研究は、やや間を置いて、1920〜30年代に F. O. Schmittらによってとりあげられた (Schmitt, 1939Schmitt FO : The ultrastructure of protoplasmic constituents. Physiol Rev 19 : 270-302, 1939)。これらの研究は、複屈折や偏光性を測定することによって、神経線維やミエリン鞘の微細構造を調べようとしたものである (Schmitt, 1939Schmitt FO : The ultrastructure of protoplasmic constituents. Physiol Rev 19 : 270-302, 1939 ; Schmitt and Bear, 1939Schmitt FO, Bear RS : The ultrastructure of the nerve axon sheath. Biol Rev 14 : 27-50, 1939)。しかしながら、1940年代の後半になると、この方向での研究は途切れてしまっている。これは、電子顕微鏡の開発によって微細構造についての研究法がそちらへ移ったためと思われる。
一方、19世紀の終わりごろには、神経活動と関係づけたもう1つの方向での光学的研究がみられる。 ・Hodge (1892) Hodge CF : A microscopical study of changes due to functional activity in nerve cells. J Morphol 7 : 95-164, 1892は、スズメ、ハト、ツバメの生体染色を施した脊髄神経節を連続的に電気刺激して、刺激前後の神経細胞、細胞核、液胞の形や、さらにそれらの色素 (osmic acid) による染まり具合を光学顕微鏡で詳細に観察し比較している。 ・同じ時期に、Mann (1894) Mann G : Histological changes induces in sympathetic, motor, and sensory nerve cells by functional activity. J Anat Physiol 29 : 100-108, 1894 もまた同様の実験をウサギ、イヌの交感神経節を用いて行い、神経活動に伴って細胞や核の大きさが増大すること、またそれらと Methyl blue や Eosinなどとの親和性が変化することを観察している。これらの研究で注目すべきことは、実験を行うにあたって、彼らが、ニューロン活動の根底にあるエネルギー消費が、何らかの形で神経細胞の形態あるいは神経組織の性状の変化に反映されるはずであるという考えを念頭においていることである。 ・さらに生体染色法を用いて、神経活動に伴う神経組織の色素による染まり具合を観察している(Lillie, 1969)Lillie RD : Uses and standardization of biological stains. In, H. J. Conn’s Biological Stains. pp1-14, The Williams & Wilkins Comp, Baltimore, 1969。
その後、今世紀に入って、神経活動とより密接に関連づけた光学的測定がなされている。 ・その先駆的役割を果たしたのは、F. O. Schmittと O. H. Schmitt (1940)Schmitt FO, Schmitt OH : Partial excitation and variable conduction in the squid giant axon. J Physiol (London) 98 : 26-46, 1940 である。彼らは、偏光顕微鏡に光電子増倍管を取り付けて、ヤリイカ (Loligo pealei) の巨大神経線維の電気的興奮に伴う複屈折の変化の測定を初めて試みたが、光学的変化を記録することはできなかった。これは、彼らが用いた当時の装置では感度が不足していたことに起因するもので、彼らも論文の末尾で、この失敗は用いられた測定装値の感度が充分でなかったためであり、もっと性能のよい装置を用いれば記録できるはずであると言及している。 ・また、もしカニの歩行脚神経を用いておれば、彼らの感度でも光学的変化は記録できたという可能性については、L. B. Cohen (1973) Cohen LB : Changes in neuron structure during action potential propagation and synaptic transmission. Physiol Rev 53 : 373-418, 1973によって指摘されている。
このSchmittらの研究に続いて神経活動の光学的研究は1950年前後に活発に行われている。その中心となったのは、D. K. Hill, R. D. Keynes, J. M. Tobiasである。 ・まず、HillとKeynes (1949) Hill DK, Keynes RD : Opacity changes in stimulated nerve. J Physiol (London) 108 : 278-281, 1949は、不成功に終わったSchmittらの試みをうける形で、カニ (shore crab : Carcinus maenus) の歩行脚神経幹を電気刺激して引き起こされる神経線維の不透明度 (opacity) の変化の測定を行った。彼らの実験では、タングステンランプから神経線維を垂直方向に白色光で照射し、スリットを通して、神経線維からの透過光 (transmitted light) をフォトセルで直接detectしている。これが、現在われわれが用いている光学測定の原型といえる。彼らはこの実験で、1秒当たり50回の電気刺激を5秒から10秒間続け、それに伴う神経線維のopacityの増大を記録することに成功した。神経刺激に伴う光学的変化の記録としては、これがおそらく最初のものである。 ・さらに、Hill (1950)Hill DK : The effect of simulation on the opacity of a crustacean nerve trunk and its relation to fibre diameter. J Physiol (London) 111 : 283-303, 1950 は測定装置に改良を加え、カニ (Maia squinado) の歩行脚神経線維を電気刺激 (50～100/secで約5～10秒) することによって、透過光強度（光散乱：light scattering）が増大することを見いだした。彼は、細胞外液の浸透圧を変えたときの神経線維の透過光の変化も調べ、その結果と照らし合わせて、測定された光散乱の変化は神経線維の直径が大きくなったことによることを示唆した。 ・Hill (1950)Hill DK : The volume change resulting from stimulation of a giant nerve fibre. J Physiol (London) 111 : 304-327, 1950 は同様の実験を、イカ (Sepia officialis) の単一巨大神経線維でも行い、この場合も、電気刺激によって光散乱が増加することを見いだし、これも神経線維の直径が大きくなったこと（容積の増大）に起因することを示唆した。そして、直径220μmの神経線維を連続して1万回の電気刺激をおこなったとき引き起こされる直径の変化は、約 0.1 であると見積もっている。 ・この結果は、その後、Cohenら (1971) Cohen LB, Hille B, Keynes RD, et al : Analysis of the potential-dependent changes in optical retardation in the squid giant axon. J Physiol (London) 218 : 205-237, 1971の実験によっても支持され、さらに、Terakawa (1988) Terakawa S : Potential-dependent variations of the intracellular pressure in intracellular perfused squid giant axon. J Physiol (London) 369 : 229-248, 1988 の、ひと工夫された方法での追試でも確かめられている。 ・J. M. Tobiasら (Tobias, 1952Tobias JM : Some optically detectable consequences of activity in nerve. Cold Spring Harbor Symp Qunt Biol 17 : 15-24, 1952 ; Bryant and Tobias, 1952Bryant SH, Tobias JM : Changes in light scattering accompanying activity in nerve. J Cell Comp Physiol 40 : 199-219, 1952 ; Tobias and Nelson, 1959Tobias JM, Nelson PG : Structure and function in nerve. In, A Symposium on Molecular Biology. pp248-265, The University of Chicago press, 1959) も神経活動に伴う光散乱変化を測定している。Tobias (1952)Tobias JM : Some optically detectable consequences of activity in nerve. Cold Spring Harbor Symp Qunt Biol 17 : 15-24, 1952 は刺激電極の陽極側では光散乱強度は小さくなり、陰極側では大きくなることを示し、それは陽極側での神経線維の収縮、陰極側での膨潤に対応することを示している。なお、この時期における光学的測定についてはTobias (1959)Tobias JM : Biophysical aspects of conduction and transmission in the nervous system. Annu Rev Physiol 21 : 299-324, 1959 による総括的なレビューにまとめられている。
ところが、1950年代の中ごろから1960年代の終わりごろまで、このような光学的測定はほとんど中断された状態になっている。これは、LingとGerard (1949) Ling G, Gerard RW : The normal membrane potential of frog sartorius fibers. J Cell Comp Physiol 34 : 383-396, 1949に始まる微小電極法の導入により、これを用いた電気生理学的研究が神経生理学の中心となったためであろう。
1968年の2つの論文 Schmittらの実験から28年経った1968年になって、光学的測定にとって新しい時代の幕開けともなった重要な2つの論文が発表された。1つは Cohen, Keynes, Hille (1968)Cohen LB, Keynes RD, Hille B : Light scattering and birefringence changes during nerve activity. Nature 218 : 438-441, 1968による論文、もう1つは TasakiとWatanabeら (1968)Tasaki I, Watanabe A, Sandlin R, et al : Changes in fluorescence, turbidity, and bireflingence associated with nerve excitation Proc Natl Acad Sci. 61 : 883-888, 1968 の論文である。
Cohen LB, Keynes RD, Hille B : Light scattering and birefringence changes during nerve activity. Nature 218 : 438-441, 1968 Tasaki I, Watanabe A, Sandlin R, et al : Changes in fluorescence, turbidity, and bireflingence associated with nerve excitation. Proc Natl Acad Sci. 61 : 883-888, 1968
・Cohenらはカニの歩行脚神経とヤリイカ (Loligo forbesi) 巨大神経線維で、単一の活動電位に伴う光散乱 (light scattering) および複屈折 (birefringence) の変化を記録することに初めて成功した。その変化は、Schmittらが予想したように非常に小さく背景光に対して10-6～10-5 のオーダーで、CAT (computer of average transcient) を用いて25～200回の掃引を加算することによって記録された。 ・一方、TasakiとWatanabeらもまた、ヤリイカ (Loligo pealei) の巨大神経線維で、活動電位に伴う複屈折変化と神経線維に吸着させたANS (8-anilinonaphthalene-1-sulfonate) の螢光変化を記録した。 この2論文が現在のニューロン活動の光学的測定の発火点ともなった。
ところで、これら2つの研究は、当初、HodgkinとHuxley (1952)Hodgkin AL, Huxley AF : A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. J Physiol (London) 117 : 500-544, 1952 による神経興奮についてのナトリウム説とその現象論的定式化の後をうけて、神経興奮の膜分子レベルでのメカニズムを探る目的で始められたものであった。実際、Tasakiらが用いたANSは、それまでにWeberとLaurence (1954)Weber G, Laurence DJR : Fluorescence indicators of adsorption in aqueous solutionand on solid phase. Biochem 56 : 1954 により、蛋白質の高次構造変化の研究に導入された疎水性プローブである。したがって、得られた光学的シグナルは、興奮に直接関係した膜分子のconformationalな変化を反映したものであることが期待され、その面から興味をもたれたのである。特に、日本ではこの傾向が強く支配した（例えば、Tasaki, 1970Tasaki I : Effects of ultraviolet and visible light on nerve fibers and changes in optical properties during nervous activity. In, Advances in Biological and MedicalPhysics. pp 307-327, Academic Press, New York, 1970 ; Kobatake, et al, 1971Kobatake Y, Tasaki I, Watanabe A : Phase transition in membrane with refer ence to nerve excitation. Adv Biophys 2 : 1-31, 1971）。
しかしながら、Cohenらは、その論文の中で、
「膜電位固定の実験で複屈折変化の時間経過が膜電位変化と同じであり、電流の時間経過とは対応性が見いだされない」
ことを示し、
「複屈折変化が、ほとんど膜電位変化に依存したものである」
ことを指摘している。ここには、すでに「膜電位の光学的測定」の伏腺が見え隠れしている。なお、Cohenら (1969) Cohen LB, Hille B, Keynes RD : Light scattering and birefringence changes during activity in the electric organ of Electrophorus electricus. J Physiol (London) 203 : 489-509, 1969はシビレエイの発電器官のシナプス前線維を電気刺激して、発電器官の90°方向の光散乱に2相性の変化が現れることを見いだし、これはシナプス伝達を反映した光学的変化であることを示唆している。シナプス機能の光学的測定のはしりである。
膜電位感受性色素の探索 複屈折と光散乱変化の膜電位依存性成分を検討したCohenら (1971, 1972Cohen LB, Keynes RD, Landowne D : Changes in light scattering that accompany the action potential in squid giant axons : potential-dependent components. J Physiol (London) 224 : 701-725, 1972) はイカ巨大神経線維の膜電位固定法の実験によりANSとTNS (2-p-toluidinyl-6-naphthale sulfonate) の螢光変化と膜電位との関係も詳しく調べた。その結果、ANS, TNSの螢光変化も、
「コンダクタンスの増大に対する構造的基礎を与えるものでなく、膜電位の変化によって引き起こされた膜構造の二次的変化についての情報を与えているに過ぎない」
と示唆した (Davila, et al, 1974Davila HV, Cohen LB, Salzberg BM, et al : Changes in ANS and TNS fluorescence in giant axons from Loligo. J Memb Biol 15 : 29-46, 1974)。これは興奮のメカニズムと関係する膜分子のconformationの変化を反映しているとするTasakiら (Conti, et al, 1971Conti F, Tasaki I, Wanke E : Fluorescence signals in ANS-stained squid giant axons during voltage-clamp. Biophysik 8 : 58-70, 1971 ; Tasaki, et al, 1972Tasaki I, Watanabe A, Hallett M : Fluorescence of squid axon membrane labelled with hydrophobic probes. J Memb Biol 8 : 109-132, 1972) の主張とは対立するもので、両グループ間で激しい論争が引き起こされた。Cohenのグループはさらにいろいろな色素について調べたが、結局、コンダクタンスの変化を反映するような色素を見いだすことはできず、観測された螢光変化はすべて膜電位を直接コピーしているだけであるという結果のみが得られたのである。
これらの実験の過程で、特にMerocyanine 540がイカ巨大神経線維の活動電位に伴って静止電位に対して 10-4 のオーダーという極めて大きな螢光変化を示すことが見いだされた(Davila, et al, 1973Davila HV, Salzberg BM, Cohen LB, et al : A large change in axon fluorescence that provides a promising method for measuring membrane potential. Nature New Biol 241 : 159-160, 1973)。さらに、この色素で、螢光だけでなく、活動電位に伴って吸光変化もまた大きく変化することが示された (Ross, et al, 1974Ross WN, Salzberg BM, Cohen LB, et al : A large change in dye absorption during the action potential, Biophys J 14 : 983-986, 1974)。 このような一連の実験結果から、
「膜電位に感受性を持つ色素 (voltage-sensitive dyes) を膜電位のプローブ (potential probe)として膜電位を光学的に測定する方法」
のアイデアがはっきりとした形となり、Cohenの研究室で、まず、ポテンシャル・プローブとしてできるだけすぐれた膜電位感受性色素の探索が始められたのである。ここに至るまでのいきさつについてはCohen (1973)Cohen LB : Changes in neuron structure during action potential propagation and synaptic transmission. Physiol Rev 53 : 373-418, 1973, Cohen and DeWeer (1977)Cohen LB and DeWeer P : Structural and metabolic processes directly related to action potential propagation. In, Handbook of Physiology, Nervous system. set. 1, vol. 1, pp137-159, 1977, Cohen and Salzberg (1978)Cohen LB, Salzberg BM : Optical monitoring of membrane potential. Rev Physiol Biochem Pharmacol 83 : 35-88, 1978 による総説に詳しく述べられている。