In biologia molecolare e in genetica, lo splicing (dall'inglese RNA splicing, a sua volta da splicing, "impiombatura") o giunzione dell'RNA o ARN è una modifica del nascente pre-mRNA che avviene insieme o dopo la trascrizione, nella quale gli introni sono rimossi e gli esoni vengono uniti. Ciò è necessario per il tipico RNA messaggero prima che possa essere usato per produrre una corretta proteina tramite la traduzione o sintesi proteica.
La maggior parte dei geni eucariotici è costituita da regioni codificanti (esoni) alternate a regioni non codificanti (introni). Queste ultime devono necessariamente essere rimosse dal trascritto primario per consentire la corretta traduzione e sintetizzare la proteina corrispondente. Alcuni introni sono presenti anche nei geni degli archei, mentre sono assenti in quelli dei batteri. Dopo la trascrizione da parte della RNA polimerasi il trascritto primario va incontro a numerose modificazioni.
I tratti da eliminare si chiamano introni (fino a 2000 basi); i tratti che codificano si chiamano esoni.
Il macchinario dello splicing: lo spliceosoma Chimicamente lo splicing avviene per due successive reazioni di transesterificazione, grazie alle quali legami fosfodiesterici sul pre-mRNA vengono rotti e altri nuovi formati. Queste reazioni sono mediate da un meccanismo molecolare che coinvolge più componenti, chiamato spliceosoma. Le sue dimensioni sono simili a quelle di un ribosoma ed è composto da circa 150 proteine e 5 RNA. Sono proprio questi ultimi a riconoscere le sequenze ai confini introne-esone ed almeno uno a partecipare alla catalisi della reazione, comportandosi come da ribozima. Per le sue reazioni lo spliceosoma idrolizza diverse molecole di ATP. I cinque RNA (U1, U2, U4, U5 e U6) sono chiamati piccoli RNA nucleari (snRNA, small nuclear RNA). Ognuno di questi si complessa con diverse proteine del macchinario, formando complessi, chiamati ribonucleoproteine nucleari (snRNP, small nuclear ribonuclear protein). La composizione dello spliceosoma varia a seconda dei passaggi della reazione: snRNP diverse entrano ed escono dalla reazione in momenti diversi, ed ognuna ha una sua funzione particolare. Le snRNP rivestono tre ruoli nello splicing: riconoscono il sito di splicing 5' e il punto di ramificazione; portano questi siti vicini quando occorre e catalizzano il taglio e la giunzione dell'RNA. Per tali funzioni sono essenziali le interazioni RNA-RNA, proteina-RNA e proteina-proteina.
La prima interazione avviene tramite l'accoppiamento di basi complementari, tra l'snRNA U1 e il sito di splicing 5' del pre-mRNA. Nel corso della reazione, questo sito di splicing viene riconosciuto dall'snRNA U6. Un altro esempio di appaiamento tra le basi è il riconoscimento del punto di ramificazione da parte dell'snRNA U2, oppure l'interazione tra gli snRNA U2 e U6. Questa interazione avvicina il sito di splicing 5' e il punto di ramificazione. Sono proprio queste interazioni e i successivi riarrangiamenti che ne conseguono che guidano la reazione di splicing e contribuiscono alla sua precisione. Anche alcune proteine non complessate con l'RNA sono coinvolte nello splicing: il fattore ausiliario U2 (U2AF) riconosce il segmento polipirimidinico e il sito di splicing 3', così che, nella fase iniziale della reazione di splicing, aiuta il legame di un'altra proteina (BBP, branch-point binding protein) al punto di ramificazione. La BBP sarà poi spiazzata dalla snRNP U2. Le altre proteine facilitano il legame tra RNA e snRNP.
Le fasi dello splicing Inizialmente, il sito di splicing 5' viene riconosciuto dalla snRNP U1. Una delle subunità di U2AF si lega al segmento polipirimidinico, mentre l'altra si lega al sito di splicing 3'.
La prima subunità interagisce con BBP e aiuta questa proteina a legarsi al punto di ramificazione. Questo arrangiamento di proteine e RNA è chiamato complesso precoce E.
A questo punto, la snRNP U2 si lega al punto di ramificazione, con l'aiuto di U2AF, e spiazza BBP. Questo arrangiamento è chiamato complesso A. L'appaiamento di basi tra l'snRNA U2 e il punto di ramificazione è tale che il residuo A del punto di ramificazione venga spinto fuori dal segmento risultante a doppia elica di RNA e formi una protuberanza a singolo nucleotide. Questa A diventa così non accoppiata e disponibile per la reazione con il sito di splicing 5'.
La fase successiva è il riarrangiamento del complesso A per l'avvicinamento di tutti e tre i siti di splicing. Questo avviene in una serie di fasi: le snRNP U4 e U6, assieme alla snRNP U5, si uniscono al complesso. Queste tre snRNP assieme sono dette tripla snRNP U4\U6*U5, in cui le snRNP U4 e U6 sono tenute assieme dall'accoppiamento complementare delle basi dei loro corrispettivi snRNA, mentre la snRNP U5 è legata in maniera più lassa attraverso interazioni proteina-proteina. Con l'ingresso della tripla snRNP U4\U6*U5 il complesso A diventa complesso B.
Nel passaggio successivo, U1 lascia il complesso e U6 lo rimpiazza al sito di splicing 5'. Questo richiede che l'appaiamento tra l'snRNP U1 e il pre-mRNA venga rotto per permettere all'RNA U6 di riappaiarsi nella stessa regione. Questi passaggi completano l'assemblaggio.
Il riarrangiamento successivo innesca la catalisi ed avviene nel modo che segue: U4 viene rilasciato dal complesso permettendo ad U6 di interagire con U2. Questo arrangiamento, chiamato complesso C, produce il sito attivo. Cioè il riarrangiamento avvicina all'interno dello spliceosoma quei componenti che assieme formano il sito attivo. Questo stesso riarrangiamento assicura che l'RNA substrato sia posizionato correttamente. Il fatto che la formazione del sito attivo sia successiva al completamento dell'assemblaggio dello spliceosoma rende il sito attivo disponibile solo nei siti di splicing corretto.
La formazione del sito attivo mette in prossimità il sito di splicing 5' del pre-mRNA e il punto di ramificazione, facilitando la prima reazione di transesterificazione.
La seconda reazione, tra i siti di splicing 5' e 3', è supportata dalla snRNP U5, che aiuta ad avvicinare i due esoni. Il passaggio finale implica il rilascio dell'mRNA e delle snRNP. Queste sono prima legate al cappio formatosi, ma vengono rilasciate in seguito alla rapida degradazione di questo frammento di RNA.
Sequenze dell'mRNA che determinano lo splicing Il confine tra esone e introne, o più specificatamente il limite all'estremità 5' dell'introne, è detto sito di splicing al 5'. Il confine introne-esone all'estremità 3' è detto sito di splicing al 3'. Questi ultimi vengono chiamati rispettivamente sito donatore e sito accettore. Per il meccanismo di splicing è necessaria un'altra sequenza che è chiamata punto di ramificazione (branch point site); quest'ultima si trova all'interno dell'introne,di solito vicino alla sua estremità 3' ed è seguita da un segmento di polipirimidine (Py tract). Le sequenze più conservate sono GU al sito di splicing 5' e AG al sito di splicing 3'; infine vi è la A, che rappresenta il punto di ramificazione. Queste sequenze conservate si trovano tutte all'interno degli introni; ciò è abbastanza normale dato che le sequenze della maggior parte degli esoni, al contrario di quelle introniche, rispondono alla necessità di codificare per gli aminoacidi specifici per i loro prodotti proteici.
Esistono ulteriori sequenze di splicing non canoniche sostituibili a GU/AG, quali AU/AC, riconosciute di RNA U differenti.
Autosplicing Alcuni rari introni sono capaci di "autocatalisi", ovvero la parte intronica dell'RNA trascritto è un ribozima che catalizza la propria escissione, con meccanismo diverso a seconda che l'introne sia di I o di II gruppo:
Lo splicing degli introni del gruppo I necessita di un nucleoside guaninico, usato come nucleofilo: il suo –OH in 3' si lega all'estremità 5' dell'introne con un legame fosfodiesterico 3'-5' al primo nucleoside dell'introne. L'ossidrile in 3' dell'esone precedente agisce da nucleofilo completando la reazione e congiungendo i due esoni.
Per gli introni del gruppo II, la reazione è simile, ma il primo nucleofilo ad agire non è un nucleoside esterno, bensì un –OH in 2' di un residuo adenilato all'interno dell'introne.
Questo meccanismo, definito "autocatalitico" perché può avvenire anche in completa assenza di proteine, riguarda rari introni di alcuni geni degli organelli degli eucarioti (gruppo II), dei geni nucleari codificanti l'rRNA di qualche eucariote (gruppo I) e di qualche gene procariotico (entrambi i gruppi).
Splicing catalizzato Il terzo gruppo di introni, che è quello più comune e che riguarda la maggior parte degli introni dei geni nucleari degli eucarioti, mostra lo stesso meccanismo di formazione del cappio utilizzando una "A" interna all'introne, di solito prossima al 3', tuttavia necessita di complessi di RNA e proteine chiamati Piccole Ribonucleoproteine Nucleari (small nuclear ribonucleoproteins o snRNP) contenenti sequenze di 100-200 nucleotidi chiamati snRNA o RNA U. Quando il complesso si lega al trascritto primario si forma lo spliceosoma. Nonostante, anche in questo caso, la catalisi sia portata avanti proprio da questi piccoli RNA, che agiscono quindi come ribozimi, il meccanismo è chiaramente assistito e quindi non autocatalitico.
Una quarta classe di introni, esemplificati da alcuni piccoli introni ritrovati nei geni che codificano tRNA in eucarioti inferiori, mostrano meccanismo molto diverso, che prevede un taglio dell'introne da parte di un enzima specifico endonucleasi, seguita da ricongiungimento degli esoni da parte di una RNA Ligasi ATP-dipendente ATP.
Esiste un ulteriore tipo catalizzato, chiamato trans-splicing che salda due esoni di trascritti primari differenti.
Queste ultime classi sono riscontrabili solo negli eucarioti.
Riconoscimento dell'introne Nel caso degli introni del terzo gruppo, nella stragrande maggioranza dei casi gli introni iniziano con la sequenza GU e terminano con la sequenza AG; queste sequenze sono riconosciute dalle macchine molecolari che devono catalizzare la giuntatura, ovvero le snRNP. Tuttavia si è riscontrato che all'interno della sequenza intronica queste coppie possono ripetersi: quindi si è ipotizzato che gli spliceosomi riconoscano altre sequenze contigue. A questo riconoscimento partecipano numerose altre proteine accessorie che vanno sotto il nome generale di "RNA-binding proteins". Un numero molto piccolo di introni della terza classe presenta, invece, sequenze alternative AT-AC. In questo caso, esistono varianti speciali delle snRNP, in grado di riconoscere i confini di questi introni.
Splicing alternativo
Questa ricorrenza (non straordinaria) di coppie GU e AG, segnala un'altra possibilità. Gli introni possono essere escissi in maniere diverse; è il caso dello splicing alternativo - cioè il processo attraverso il quale, mediante un diverso arrangiamento degli esoni (regioni di RNA codificanti), da uno stesso gene possono derivare diverse proteine, dette isoforme.
Recenti stime basate su dati di RNA sequencing affermano che il 90%, 60% e il 25% dei geni di Homo sapiens, Drosophila melanogaster e Caenorhabditis elegans subiscono splicing alternativo.
Sull'mRNA è possibile individuare dei siti di splicing "forti" e altri siti "deboli"; questi ultimi sono dei siti criptici ossia siti che normalmente non sono riconosciuti come siti di splicing e che invece, vengono identificati come tali, in particolari condizioni: il riconoscimento di tali siti permette la produzione di proteine differenti a partire dallo stesso mRNA.
Da cosa dipende il riconoscimento di questi siti di splicing? Una regione molto importante è quella che è situata tra il sito di ramificazione e il 3' dell'introne ad una distanza di 20-50 bp dall'estremità 3'. Questa regione è ricca in pirimidine ; il riconoscimento del sito di splicing al 3' dipende proprio dalla vicinanza di quest'ultimo al sito di pirimidine.