La reazione a catena della polimerasi, in breve PCR (dall'inglese polymerase chain reaction), è una tecnica di biologia molecolare che consente la moltiplicazione (amplificazione) di frammenti di acidi nucleici dei quali si conoscono le sequenze nucleotidiche iniziali e terminali. L'amplificazione mediante PCR consente di ottenere in vitro molto rapidamente la quantità di materiale genetico necessaria per le successive applicazioni.
Tale metodo fu ideato nel 1983 da Kary Mullis, per il quale ottenne il premio Nobel per la chimica nel 1993.
Kary Mullis raconta nella sua autobiografia Dancing naked in the mind field come l'assunzione di LSD lo avesse portato alla "visione" del meccanismo della PCR.
In risposta a un'intervista per il documentario della BBC Psychedelic Science, dichiara: "Cosa sarebbe successo se non avessi mai preso l'LSD? Avrei inventato la PCR ugualmente? Non lo so. Ne dubito. Ho seri dubbi".
Meccanismo di funzionamento
La PCR ricostruisce in vitro uno specifico passaggio della duplicazione cellulare: la ricostituzione (sintesi) di un segmento di DNA "completo" (a doppia elica) a partire da un filamento a singola elica. Il filamento mancante viene ricostruito a partire da una serie di nucleotidi (i "mattoni" elementari che costituiscono gli acidi nucleici) che vengono disposti nella corretta sequenza, complementare a quella del DNA interessato.
Questo processo viene svolto in natura da enzimi chiamati DNA polimerasi, che sono in grado di sintetizzare progressivamente un nuovo filamento di DNA nelle seguenti condizioni: devono essere disponibili i nucleotidi da polimerizzare, sotto forma di desossiribonucleosidi trifosfati (dNTP); il DNA deve essere denaturato, ovvero le due eliche che compongono i filamenti devono essere già separate; il segmento da ricostruire può essere soltanto prolungato, ovvero non è possibile sintetizzare un nuovo filamento a partire da zero; devono inoltre essere rispettate opportune condizioni di temperatura, pH, ecc.
È possibile quindi ricostruire le condizioni che portano alla formazione dei nuovi segmenti di DNA, ponendo in soluzione:
una quantità, anche minima, del segmento di DNA che si desidera riprodurre; una quantità opportuna di nucleotidi liberi per costituire i nuovi filamenti; opportuni "inneschi", detti primer, costituiti da brevi sequenze di DNA (oligonucleotidi) complementari alle estremità 5' e 3' dei due filamenti del segmento da riprodurre; una DNA polimerasi termo-resistente (non è necessario che provenga dallo stesso organismo di cui si deve replicare il DNA); un tampone che serve a mantenere stabile il pH adatto alla reazione; altri elementi di supporto (ad es. ioni magnesio) indispensabili per il corretto funzionamento della DNA polimerasi.
Per avviare la reazione della polimerasi (fase di prolungamento del filamento a partire dal primer 5') è prima necessario provvedere alla separazione dei filamenti del DNA (fase di denaturazione), quindi alla creazione del legame tra i primer e le regioni loro complementari dei filamenti di DNA denaturati (fase di annealing). Questo processo risulta però incompatibile con la DNA polimerasi umana, che viene distrutta alle temperature necessarie alla denaturazione (96-99 °C).
Per ovviare a questo inconveniente si fa ricorso alle polimerasi appartenenti a organismi termofili che non sono inattivate dalle alte temperature, ad esempio la Taq polimerasi proveniente dal batterio termofilo Thermus aquaticus. Ciò consente di realizzare più cicli di PCR in sequenza, in ciascuno dei quali viene duplicato anche il DNA sintetizzato nelle fasi precedenti, ottenendo una reazione a catena che consente una moltiplicazione estremamente rapida del materiale genetico di interesse.
Schema di un ciclo di PCR La soluzione di DNA da replicare, desossiribonucleotidi trifosfati, ioni magnesio, primer e TAQ polimerasi viene portata a una temperatura compresa tra 94 e 99 °C. Ci si trova, di conseguenza, in una situazione in cui la doppia elica del DNA viene completamente scissa e i due filamenti di cui essa è composta sono liberi (fase di denaturazione). Successivamente la temperatura viene abbassata fino a 40-55 °C circa al fine di permettere il legame dei primer alle regioni loro complementari dei filamenti di DNA denaturati (fase di annealing). Infine la temperatura viene alzata fino a 65-72 °C al fine di massimizzare l'azione della TAQ polimerasi che determina un allungamento dei primer legati, utilizzando come stampo il filamento singolo di DNA (fase di prolungamento).
Il ciclo descritto viene poi ripetuto numerose volte: ma in genere non si superano i 25-30 cicli in quanto a un certo punto la quota di DNA ottenuto raggiunge un plateau. Ciò avviene, ad esempio, per carenza degli oligonucleotidi usati come inneschi o per diminuzione dei dNTP. Bisogna inoltre considerare che si potrebbe amplificare in maniera eccessiva anche eventuale materiale genomico contaminante.
Efficienza In linea teorica ogni ciclo dovrebbe raddoppiare la quantità di DNA; ciò, tuttavia, non si realizza. Per avere una stima sufficientemente attendibile del numero di filamenti di DNA ottenuti dopo cicli si può ricorrere alla formula:Ramakers, C., Ruijter, J., Deprez, R., and Moorman, A. (2003). Assumption-free analysis of quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) data. Neuroscience Letters, 339(1), 62–66.
dove:
= DNA prodotto dopo cicli = quantità iniziale di DNA presente = numero di cicli di PCR effettuati = efficienza dell'amplificazione (in genere compresa tra 0,7 e 0,8)
Allestimento di una PCR
La scelta del bersaglio La scelta del bersaglio genetico da amplificare tramite PCR dipende da ciò che si è interessati a ottenere e per tale motivo si ricorre a differenti strategie come, ad esempio: in caso di malattie genetiche o tumorali viene amplificato il gene responsabile di tali stati patologici (il gene in questione deve essere stato già riconosciuto), in caso di malattie infettive si possono amplificare geni del microorganismo in questione che codifichino per funzioni vitali essenziali o per fattori di virulenza.
Il bersaglio da amplificare può anche essere una molecola di RNA (come, ad esempio, nel caso di alcuni virus) la quale deve essere, come primo passo, sottoposta a una reazione di retrotrascrizione.
La quantità di materiale bersaglio Per effettuare una PCR si può benissimo utilizzare una piccola quantità di bersaglio in quanto la sensibilità della reazione è molto alta. Si è visto che una quantità di DNA genomico di 100 ng è sufficiente per identificare un gene bersaglio che è presente in una singola copia. La presenza d'un basso quantitativo di bersaglio, comunque, aumenta la probabilità che vengano amplificate sequenze non specifiche.
Una quantità troppo elevata di DNA, al contrario, può diminuire l'efficienza dell'amplificazione a causa della presenza di troppi elementi contaminanti e può rendere complessa la valutazione della resa della reazione durante i processi di ottimizzazione dei singoli parametri per cercare di allestire tutta la PCR. Durante le fasi d'allestimento d'una PCR sarebbe bene, per evitare le problematiche appena riportate, cercare d'ottimizzare la quantità di DNA utilizzata (anche se non sempre ciò è possibile) mandando una serie di reazioni d'amplificazione in cui tutti i parametri siano fissi tranne il quantitativo di DNA che viene impiegato in dosi scalari.
Per poter far ciò, comunque, è necessario poter valutare la quantità di DNA ottenuta durante il processo di estrazione e ciò può essere ottenuto tramite una lettura spettrofotometrica d'una aliquota dell'estratto in cui viene misurata l'assorbanza a 260 nm, e tenendo conto del fatto che un valore di assorbanza di 1 con un cammino di 1 cm corrisponde a 50 µg/ml di DNA a doppia elica e a 40 µg/ml di DNA a singola elica o di RNA. Effettuando, inoltre, una lettura a una lunghezza d'onda di 280 nm (picco d'assorbanza delle proteine, principale contaminante degli estratti) ed effettuando il rapporto tra le rispettive assorbanze a 260 e 280 nm si può ottenere una stima della purezza del DNA ottenuto (in genere in preparazioni pure di DNA od RNA tale rapporto vale, rispettivamente, 1,8 e 2,0). La lettura a 230 nm, invece, riflette la presenza di contaminanti quali: fenolo, composti aromatici, peptidi e carboidrati. Il rapporto tra l'assorbanza a 260 nm e quella a 230 nm permette di evidenziare la contaminazione da tali agenti (nelle preparazioni pure vale 2,2).
Preparazioni in cui i rapporti sopra indicati si discostano significativamente da quelli delle preparazioni pure sono indice di contaminazione e ciò fa sì che la stima della concentrazione di DNA ottenuto sia meno accurata. Altri fattori che possono inficiare l'efficienza dell'amplificazione sono: la presenza di DNA circolare e il suo peso molecolare. Effettivamente l'efficienza d'amplificazione è leggermente inferiore in molecole di DNA circolari o che abbiano un peso molecolare troppo elevato per cui, in questi casi, è consigliabile utilizzare appositi enzimi di restrizione che permettano, rispettivamente, di linearizzare il materiale genomico o di ridurlo in frammenti più piccoli.
I controlli L'allestimento d'opportuni controlli di qualità permette di valutare la sensibilità e specificità della metodica, nonché di evidenziare la presenza di falsi positivi o falsi negativi. I controlli da utilizzare sono detti "positivo" e "negativo".
Il controllo positivo consiste in un campione in cui la sequenza bersaglio è contenuta. Tale controllo non dovrebbe contenere un numero di copie di sequenza bersaglio troppo alto (in genere tra 105 e 106). Ciò al fine di evitare di creare pericolosi aerosol che possano contaminare altri campioni o di sottostimare eventuali cali di sensibilità della reazione con produzione di falsi negativi. Il controllo negativo consiste in un campione in cui la sequenza bersaglio manca. Esso serve per evidenziare eventuali contaminazioni che potrebbero riferirsi sia all'estrazione del materiale genomico, sia al momento di preparazione della PCR. I primer La scelta dei primer da utilizzare costituisce un aspetto essenziale per la buona riuscita della PCR. Essi, infatti, devono potersi ibridare in maniera specifica ed efficiente alla sequenza d'interesse, tralasciando quelle aspecifiche. La tipologia di primer da usare varia a seconda dello scopo della PCR.
Nel caso di malattie infettive risulta conveniente ricorrere a primer che siano specie-specifici o che possano efficacemente distinguere tra ceppi patogeni e non. Per la diagnosi di patologie genetiche si può ricorrere, invece, a due strategie: primer che siano complementari a regioni adiacenti a quella in cui si trova la mutazione da individuare oppure primer in cui uno dei due sia complementare alla sequenza mutata. In quest'ultimo caso si avrà che, in assenza della mutazione, non si avrà alcun prodotto d'amplificazione. Poiché la complementarità dei primer rispetto alla sequenze bersaglio può non essere assoluta si può ricorrere all'uso di primer contenenti alcuni nucleotidi non complementari (per creare, ad esempio, siti di taglio per enzimi di restrizione) o primer degenerati (cioè miscele di oligonucleotidi che variano tra loro per la presenza di differenti basi in punti specifici). Questi ultimi consentono di poter identificare geni di cui sia nota solo la sequenza proteica o geni omologhi tra diverse specie.