L'immunoistochimica (o IHC, dall'inglese Immunohistochemistry) è una tecnica di laboratorio ampiamente utilizzata in anatomia patologica, istologia e ricerca biomedica, che consente di identificare, localizzare e quantificare specifiche proteine o molecole bersaglio all'interno di sezioni di tessuto.
La tecnica sfrutta il principio della specifica affinità di legame tra un antigene (la molecola da ricercare) e un anticorpo prodotto appositamente contro di esso. Il legame viene successivamente evidenziato al microscopio ottico o a fluorescenza grazie all'impiego di marcatori accoppiati agli anticorpi, quali enzimi cromogeni (come la perossidasi del rafano), fluorofori o elementi elettrondensi.
Sviluppatasi a partire dalla metà del XX secolo, l'immunoistochimica è divenuta uno strumento diagnostico di fondamentale importanza nella patologia oncologica. Essa permette non solo di stabilire l'istogenesi e la natura di tumori anaplastici o poco differenziati, ma anche di identificare bersagli terapeutici specifici per la medicina di precisione e la terapia personalizzata dei tumori.
Storia
La storia dell'immunoistochimica ha inizio nel 1941 grazie all'intuizione del medico e immunologo statunitense Albert Coons. Coons e i suoi collaboratori svilupparono una tecnica innovativa per coniugare un composto chimico fluorescente, la fluoresceina, ad anticorpi diretti contro lo Streptococcus pneumoniae. Questa scoperta rese possibile per la prima volta la localizzazione visiva degli antigeni nei tessuti mediante l'uso del microscopio a fluorescenza, ponendo le basi per l'immunodiagnostica moderna.
Un cambio di passo fondamentale si verificò a metà degli anni '60 con l'introduzione dei marcatori enzimatici. Nel 1966, Paul Nakane e George Pierce (unitamente agli studi condotti da Stratis Avrameas) dimostrarono la possibilità di legare gli anticorpi ad enzimi anziché a fluorofori. L'impiego della perossidasi del rafano (HRP) combinata con il cromogeno diaminobenzidina (DAB) rappresentò una vera rivoluzione: i preparati potevano essere finalmente osservati con un comune microscopio ottico e conservati in modo permanente senza il rapido decadimento del segnale tipico delle sostanze fluorescenti.
Nei decenni successivi, la ricerca si concentrò sull'aumento della sensibilità della tecnica per identificare antigeni presenti in quantità minime. Nel 1970 Ludwig Sternberger mise a punto la tecnica del complesso perossidasi-antiperossidasi (PAP), superata nel 1981 dall'introduzione del metodo avidina-biotina (ABC) ideato da Su-Ming Hsu. Sfruttando la straordinaria affinità di legame tra la proteina avidina e la vitamina biotina, il sistema ABC divenne lo standard globale nei laboratori di anatomia patologica per oltre un ventennio.
Nel 1991, Shan-Rong Shi e i suoi collaboratori segnarono un'ulteriore svolta decisiva scoprendo che il riscaldamento delle sezioni di tessuto immerse in soluzioni tampone (Heat-Induced Epitope Retrieval, HIER) ripristinava la reattività degli epitopi alterati dalla fissazione in formalina. Questa intuizione ha reso possibile l'applicazione di routine dell'immunoistochimica sui campioni d'archivio inclusi in paraffina.
In epoca contemporanea, l'evoluzione tecnologica ha portato allo sviluppo dei sistemi a polimero privi di biotina, capaci di eliminare le reazioni aspecifiche causate dalla biotina endogena tissutale. L'adozione di coloratori automatici e l'integrazione con la patologia digitale e l'intelligenza artificiale hanno infine reso la diagnostica immunoistochimica una tecnica ad altissima riproducibilità e standardizzazione.
Principio e metodiche di rivelazione Il principio fondamentale dell'immunoistochimica risiede nel riconoscimento stereospecifico tra l'epitopo di un antigene tissutale e il paratope di un anticorpo primario, prodotto in specie animali tramite immunizzazione (anticorpi policlonali) o da cloni cellulari ibridomi (anticorpi monoclonali). Per rendere visibile al microscopio questo complesso invisibile si impiegano diverse strategie metodologiche.
Metodo diretto
Nel metodo diretto si impiega un unico anticorpo primario specifico per l'antigene di interesse, al quale è stato preventivamente coniugato il marcatore (un enzima come la perossidasi o un fluoroforo). Sebbene questa modalità sia rapida e richieda un solo passaggio di incubazione, viene impiegata raramente nella diagnostica di routine poiché offre una scarsa sensibilità: a ogni molecola d'antigene si lega un numero limitato di molecole di marcatore, rendendo difficile l'evidenziazione di bersagli poco espressi.
Metodo indiretto
Il metodo indiretto prevede una procedura a più stadi: l'anticorpo primario non marcato si lega specificamente all'antigene; successivamente, viene applicato un anticorpo secondario marcato, diretto contro la porzione costante (Fc) delle immunoglobuline della specie animale in cui è stato generato il primario. Poiché più molecole di anticorpo secondario possono legarsi a differenti epitopi di un singolo anticorpo primario, si ottiene un significativo effetto di amplificazione del segnale microscopico, aumentando sensibilmente la sensibilità della colorazione.
Sistemi a polimero Nelle metodiche contemporanee, la rilevazione indiretta tradizionale è stata in gran parte sostituita dai sistemi a polimero idrosolubile (spesso costituiti da dorsali di destrano). A queste catene polimeriche sono legate contemporaneamente numerose molecole di anticorpo secondario ed elevate quantità di enzima (HRP o fosfatasi alcalina). Questo approccio garantisce una straordinaria amplificazione del segnale priva delle interferenze causate dalla biotina endogena, riducendo al contempo i tempi di incubazione e lo sfondo aspecifico. Fasi del procedimento operativo Il successo e la riproducibilità di una reazione immunoistochimica dipendono dall'esecuzione rigorosa di una serie di fasi sequenziali di laboratorio. Ciascuno stadio del protocollo è finalizzato a bilanciare due esigenze fondamentali: preservare l'architettura morfologica del tessuto e garantire la massima accessibilità degli epitopi alla specifica componente anticorpale.
Fissazione, sparaffinatura e reidratazione La preparazione del campione rappresenta il presupposto critico per la buona riuscita dell'analisi. La stragrande maggioranza dei campioni bioptici e chirurgici destinati alla diagnostica di routine viene sottoposta a fissazione mediante immersione in una soluzione di formalina tamponata neutra al 10% (pari a una concentrazione di formaldeide a circa il 4%). Questo processo forma legami crociati a ponte metilenico tra i residui amminici delle proteine tissutali, bloccando i processi di autolisi e stabilizzando la struttura cellulare.
Successivamente, i campioni disidratati vengono inclusi in paraffina liquida (creando i blocchi definiti FFPE, dall'inglese Formalin-Fixed Paraffin-Embedded) e sezionati mediante un microtomo in sfoglie sottilissime, di spessore compreso tra i 3 e i 5 micrometri. Le sezioni vengono quindi distese e adagiate su speciali vetrini portaoggetto ricoperti di sostanze ad adesione positiva (quali la polilisina o il silano), indispensabili per prevenire il distacco del tessuto durante i successivi e aggressivi trattamenti chimico-fisici.
Poiché i reagenti immunoistochimici sono soluzioni acquose, la paraffina idrofobica deve essere totalmente eliminata dal vetrino. Questo stadio, noto come sparaffinatura, si ottiene immergendo i vetrini in solventi organici aromatici come lo xilene o suoi sostituti a minore tossicità. Una volta rimossa la paraffina, si procede alla reidratazione progressiva del tessuto facendolo passare attraverso una scala alcolica a concentrazione decrescente (da etanolo assoluto a soluzioni alcoliche al 95%, 70% e infine acqua distillata), ripristinando l'ambiente acquoso idoneo per le reazioni immunologiche.
Recupero antigenico Nonostante l'eccellente preservazione morfologica garantita dalla formalina, l'azione dei ponti metilenici altera la conformazione tridimensionale delle proteine, nascondendo o mascherando gli epitopi riconosciuti dagli anticorpi. Per ovviare a questo inconveniente si applicano le metodiche di recupero antigenico (Antigen Retrieval), volte a rompere tali legami e svelare i siti di combinazione antigenica.
La tecnica di elezione è il recupero indotto dal calore (Heat-Induced Epitope Retrieval, HIER). Essa prevede l'immersione dei vetrini in soluzioni tampone a pH controllato (comunemente tampone citrato a pH 6.0 oppure Tris-EDTA a pH 9.0) e il loro successivo riscaldamento ad alte temperature (tra i 95 °C e i 120 °C) mediante l'impiego di bagni maria termostatici, forni a microonde, pentole a pressione o sistemi automatici integrati. La combinazione di calore energetico e pH del tampone rompe la trama dei legami crociati non covalenti, restituendo alla molecola la conformazione spaziale nativa.
In casi più rari, o per specifici antigeni della matrice extracellulare, si adotta il recupero indotto da enzimi (Protease-Induced Epitope Retrieval, PIER). Tale processo sfrutta la digestione enzimatica controllata mediante incubazione con proteasi quali pepsina, tripsina o proteinasi K. Questa modalità richiede tuttavia un monitoraggio estremamente rigoroso dei tempi e delle temperature di reazione per evitare l'eccessiva degradazione della struttura microscopica del tessuto.
Blocco delle reazioni aspecifiche e dello sfondo Una fase cruciale per evitare falsi positivi o la presenza di uno sfondo (background) cromatico intenso consiste nell'inattivazione delle sostanze endogene tissutali che potrebbero reagire direttamente con i sistemi di rilevazione.
Nei metodi che utilizzano l'enzima perossidasi (HRP), il tessuto contiene spesso una quota di perossidasi endogena, particolarmente abbondante nei globuli rossi, nei granulociti e negli epatociti. Per inattivarla, le sezioni vengono pre-trattate con una soluzione diluita di perossido di idrogeno (acqua ossigenata al 3% in metanolo o acqua tampone). Qualora si utilizzino sistemi basati sull'enzima fosfatasi alcalina o sulla biotina, si effettuano analoghi pre-trattamenti bloccanti con acido levamisolo o soluzioni di avidina/biotina libera.
In aggiunta, per prevenire l'adesione aspecifica dell'anticorpo primario dovuta a interazioni di carica elettrostatica o idrofobica con le proteine del tessuto, la sezione viene incubata con soluzioni bloccanti aspecifiche contenenti siero normale non immune (proveniente dalla stessa specie animale in cui è stato generato l'anticorpo secondario) oppure albumina di siero bovino (BSA).
Reazione immunologica e sviluppo del cromogeno Superate le fasi preparatorie, il tessuto viene messo a contatto con l'anticorpo primario a una concentrazione ottimale (titolata) e incubato per un tempo variabile, compreso tra un'ora a temperatura ambiente e una notte a 4 °C. Segue l'applicazione del sistema di rilevazione scelto, come un anticorpo secondario biotinilato o, più comunemente nei laboratori moderni, un polimero idrosolubile coniugato a molteplici molecole di enzima.
La presenza dell'antigene viene infine manifestata attraverso la reazione cromogenica. L'enzima legato al complesso molecolare agisce su un substrato cromatico trasformandolo in un precipitato colorato insolubile direttamente nel sito di reazione: La 3,3'-diaminobenzidina (DAB) è il cromogeno maggiormente impiegato in associazione con la perossidasi. La reazione genera un deposito insolubile di colore marrone intenso che resiste ai solventi organici. Il 3-ammino-9-etilcarbazolo (AEC) produce invece un precipitato di colore rosso brillante, ma essendo solubile negli alcol richiede un montaggio finale con terreni acquosi. Controcolorazione e chiusura del vetrino