Microscopio confocale

Il microscopio confocale è un microscopio ottico, uno strumento scientifico che si basa su una tecnologia volta ad accrescere sensibilmente la risoluzione spaziale del campione, eliminando gli aloni dovuti alla luce diffusa dai piani fuori fuoco del preparato.

Un primo brevetto risale al 1884, quando a soli 24 anni Paul Gottlieb Nipkow registrò il "Telescopio Elettrico" basato sul principio del disco rotante da lui osservato.

Le basi teoriche dello strumento, in senso lato, vennero poste verso la metà degli anni 1950 dallo scienziato attivo nel campo dell'intelligenza artificiale, Marvin Lee Minsky.

I primi apparati progettati, effettivamente costruiti e diffusi in campo applicativo furono microscopi con tecnologia CSLM, costruiti nel Regno Unito all'inizio degli anni 1990 ed inizialmente commercializzati dalla ditta Bio-Rad, sulla base di ricerche e prototipazioni condotte al MRC Laboratory of Molecular Biology di Cambridge da William Bradshaw AmosWhite, J.G., 1987. Confocal Scanning Microscope - U.K. Patent Application GB 2 184 321 A (filed 15 Dec 1986). negli anni 1980.

Caratteristiche generali

Lo strumento opera nel campo convenzionale degli ingrandimenti della normale microscopia ottica, ed è schematicamente costituito da un normale microscopio a trasmissione a cui viene sovrapposto un apparato che si occupa di illuminare e rilevare l'immagine di un campione illuminato con una scansione punto a punto.

Esistono diverse tecniche per ottenere questo risultato: a disco rotante (Nipkow disk), Programmable Array Microscopes (PAM), e laser. Quest'ultimo tipo, il più diffuso e denominato CLSM, acronimo di Confocal Laser Scanning Microscope, è un evoluto microscopio a fluorescenza che permette di focalizzare con estrema precisione un laser sul preparato, aumentando notevolmente la risoluzione e la profondità di campo.

La sua sorgente luminosa è costituita da uno o più laser, generalmente a semiconduttore, per ogni diversa frequenza di eccitazione richiesta. Il meccanismo di direzione del fascio luminoso viene gestito da sistemi computerizzati. Le immagini ottenute, sincronizzando col fascio di eccitazione il dispositivo di rivelazione, sono particolarmente definite e spettacolari, e possono permettere di evidenziare con differenti colori le diverse molecole presenti nel preparato, permettendo di apprezzarne la tridimensionalità (esempio particolarmente apprezzabile in campo biologico, utilizzando tecniche di immunofluorescenza, la fotomicrografia a lato con actina in rosso, tubulina del citoscheletro in verde e DNA del nucleo in blu).

Storia

Minsky realizzò il primo microscopio confocale nel 1955, mentre lavorava, come membro della Harvard Society of Fellows, su un metodo per raccogliere immagini definite di denso tessuto neuronale.

Le tecniche tradizionali disponibili all'epoca ottenevano solo un diffuso bagliore, dovuto alla luce diffratta dai piani fuori fuoco: l'alta densità di cellule nervose interconnesse, marcate con fluorocromi e illuminate tutte allo stesso modo, faceva sì che l'obiettivo raccogliesse troppa radiazione indesiderata, riducendo di molto il rapporto segnale/rumore.

L'idea risolutiva fu quella di illuminare selettivamente un solo punto oggetto per volta e spostare tale punto sul piano focale, scandendolo nelle due direzioni del piano oggetto per creare l'immagine finale.

Il progetto originale di Minsky presentava, al posto della lente-condensatore, una lente identica all'obiettivo, mentre l'illuminazione, fornita da una lampada allo zirconio, era limitata da un pinhole. L'immagine ridotta di quest'ultimo andava a fuoco sull'oggetto, creando un singolo disco luminoso. Un secondo pinhole, posto fra l'obiettivo e il fotomoltiplicatore di rivelazione, contribuiva ad eliminare l'eventuale luce diffusa dai piani non a fuoco.

Ci si trova dunque davanti ad una geometria simmetrica, semplice ed eleganteMarvin Minsky. «Memoir on Inventing the Confocal Scanning Microscope». In: Scanning 10 (2000), pp. 128–138..

Il sistema di scansione prevedeva il movimento del campione grazie a due aste oscillanti di metallo elastico, poste ortogonalmente e controllate da elettromagneti. La variazione di intensità luminosa, modulata dal campione e tradotta in fotocorrente, creava l'immagine finale grazie ad un tubo catodico a lunga persistenzaMarvin Minsky. Microscopy apparatus. US Patent n° 3013467. Dic. 1957..

Principio di funzionamento

Il metodo di formazione dell'immagine in un microscopio confocale differisce da quello di un microscopio composto convenzionale per il fatto che, mentre nel secondo il fascio di illuminazione investe l'intero campione e forma istantaneamente l'immagine sul rivelatore, nel primo la luce proveniente dalla sorgente illumina l'oggetto un solo punto per volta ed è necessaria una scansione per formare l'immagine finale. L'uso di questa tecnica permette di raggiungere risoluzioni assiali molto ridotte. Infatti un'immagine così ottenuta viene comunemente chiamata “sezione ottica”, in riferimento al fatto che è possibile indagare il campione nelle tre dimensioni spaziali con un metodo non invasivo.

In microscopia confocale lo spot di luce puntiforme è prodotto da un pinhole posto davanti alla sorgente, ossia in sostituzione del diaframma di campo, che risulta così fisso e molto ridotto. La luce viene poi focalizzata dal collettore e dal condensatore (o dall'obiettivo, nel caso di configurazione in luce riflessa) sul campione, per poi essere raccolta dall'obiettivo e dall'eventuale oculare e focalizzata su un secondo pinhole. In corrispondenza di questo è presente anche il rivelatore d'immagine, che produce un segnale proporzionale all'intensità della luce che lo colpisce.

Il pinhole di illuminazione e quello di rivelazione appartengono a piani focali coniugati e si dicono dunque confocali, da cui il nome di questa particolare tecnica microscopica.

La quasi totalità dei sistemi confocali moderni utilizza la configurazione in luce riflessa, che, come anticipato da Minsky stesso, aumenta la simmetria e la risoluzione del sistema a spese della luminosità, che si riduce per la presenza dello specchio dicroico o del beam-splitter.

Confocalità e Principio di Köhler Va fatto notare che la confocalità e il principio di Köhler intervengono su aspetti differenti della struttura di un microscopio e, almeno in teoria, non sono in conflitto: il rispetto del principio di Köhler determina l'esistenza di due ben distinti insiemi di piani focali coniugati e la conseguente possibilità di regolare campi e aperture in modo indipendente, grazie a diaframmi posizionati in punti dell'asse ottico facilmente identificabili; la confocalità comporta invece l'estremo restringimento dei campi del microscopio, ottenendo una drastica riduzione della luce diffusa dai piani fuori fuoco e il notevole incremento della risoluzione assiale, grazie alla diminuzione della profondità di campo apparente.

A livello pratico, purtroppo, il rispetto del principio di Köhler in un microscopio confocale risulta molto problematico. I pinhole costituiscono un ostacolo al passaggio della luce e la soluzione che sorge spontaneamente consisterebbe nel focalizzarla proprio nel punto in cui questi sono posizionati. Ciò però non è possibile, perché in tal modo la sorgente andrebbe a fuoco sull'oggetto, il cui piano è coniugato con quello dei pinhole. Si deve allora cercare di ottenere un fascio collimato tanto stretto da attraversare i pinhole con perdite trascurabili: un problema non semplice, in particolar modo quando le dimensioni in gioco sono vicine ai limiti diffrattivi dello strumento. Fortunatamente, essendo il campo oggetto idealmente puntiforme, ossia di diametro idealmente infinitesimo, il problema dell'uniformità di illuminazione non è tanto grave quanto in microscopia tradizionale e, con le dovute cautele, può essere adottata l'illuminazione critica.

Risoluzione confocale laterale Si definiscono : coordinata radiale sul piano di formazione dell'immagine ( nel punto di intersezione fra il piano immagine e l'asse ottico del sistema) : apertura numerica dell'obiettivo : ampiezza luminosa (PSF) sul piano immagine : intensità luminosa dell'immagine : larghezza a mezza altezza del picco centrale di , anche detta FWHM dall'inglese full width at half maximum", identifica la distanza dal punto di massimo alla quale l'intensità si dimezza e l'ampiezza di riduce di un fattore (-3 dB); questo valore viene anche identificato come la risoluzione puntuale del sistema. : risoluzione laterale del microscopio secondo il criterio di Rayleigh. In ipotesi di parassialità e ottiche perfette, si può dimostrare che il microscopio confocale ideale, ossia quello con pinhole infinitesimi, ha una PSF , cioè il quadrato di quella valida per un microscopio tradizionale.

Questo significa che un microscopio confocale può fornire un'immagine meglio definita di oggetti puntiformi, bordi e dettagli in generale.

Lo stesso si può dire per la distribuzione di intensità : in figura si vede come entrambe le tipologie di microscopio riescono a rispondere al medesimo intervallo di frequenze spaziali; la differenza sta nella rapidità con cui cala la risposta, determinando un maggior contrasto per il sistema confocale.

Come per il microscopio standard, si definisce la risoluzione puntuale , che corrisponde alla FWHM di :

che risulta inferiore di circa il 27% rispetto a quella del microscopio tradizionale.

Questo parametro però, come anticipato, non significa una migliore risoluzione trasversale per l'approccio confocale, bensì un miglior confinamento dello spot, ossia miglior contrasto.

Ciò giustifica la possibilità di imaging con luce coerente in assenza di speckle; infatti i lobi laterali del disco di Airy subiscono un'attenuazione di 26 dB rispetto al picco centrale, contro i 18 dB del microscopio standard.

Poiché lo speckle è generato dalla somma dei lobi laterali di molti punti vicini, l'effetto diventa quasi impercettibile nel caso confocale.

Il criterio di Rayleigh definisce la risoluzione laterale del sistema confocale ideale, quando questa è limitata dalla sola diffrazione

che risulta minore dell'8% rispetto a quella del microscopio tradizionale.

Risoluzione confocale assiale Per calcolare l'entità del contributo diffrattivo alla risoluzione assiale di un sistema confocale si fa riferimento alla Teoria scalare per il punto riflettore.

Si assume che l'obiettivo, privo di aberrazioni per ipotesi, venga illuminato con un fascio collimato.

Attraverso alcuni calcoli si ottiene l'estensione assiale della figura di diffrazione al di sopra e al di sotto del piano immagine confocale, intesa come la FWHM di :

NB. Lo sviluppo di Taylor di attorno a zero è

Applicando a il criterio di Rayleigh si ottiene invece l'effettiva risoluzione assiale del sistema confocale con pinhole infinitesimo in presenza della sola diffrazione:

che risulta minore dell'11% rispetto a quella del microscopio standard.

In definitiva, con l'impiego della configurazione confocale, si osserva un incremento teorico delle prestazioni, dovuto alla riduzione del contributo diffrattivo e ad un aumento del contrasto.

Si nota che le approssimazioni effettuate sono sufficientemente accurate solo per .

L'analisi qui riportata mette in luce solo gli aspetti legati alla diffrazione e, rispetto alla realtà, i risultati ottenuti rappresentano solo stime ottimistiche. Infatti si può dimostrare sperimentalmente che le inevitabili aberrazioni introdotte dalle lenti allargano il picco centrale della PSF calcolata, modificando l'altezza dei lobi laterali e alterandone la simmetria.

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