La villocentesi, o prelievo dei villi coriali, consiste nell'aspirazione di una piccola quantità di tessuto coriale (10-15 mg).
Il prelievo dei villi coriali trova la sua ratio nella considerazione che il trofoblasto ed il feto originano dal medesimo tessuto.
L'applicazione della tecnica del DNA alla diagnosi prenatale di una affezione monogenica venne praticata per la prima volta nel 1976 e fu mirata alla ricerca della mutazione genica responsabile dellalfa-talassemia.
A questa prima esperienza ne seguirono molte altre, sia sui villi coriali che nel liquido amniotico, fino al giorno d'oggi, in cui si può dire che le possibilità di diagnosticare una affezione genica in epoca prenatale con il DNA non riconosce altro limite se non quello della conoscenza e marcatura genica del sito o dei siti responsabili della malattia. In altri termini, ogniqualvolta i biologi molecolari o i genetisti riconoscono il gene di una affezione nell'adulto, questa ricerca può essere eseguita anche nel feto.
L'approccio per via transaddominale fu suggerito nel 1984 e largamente utilizzato dalla seconda metà degli anni ottanta con indubbi vantaggi, rispetto al prelievo transcervicale, sia per la maggiore familiarità degli operatori con tale via di approccio, che per il minor rischio di infezione intrauterina.
La validità dell'analisi dei villi coriali come esame di diagnosi prenatale è stato dimostrato per la prima volta nel mondo dallo scienziato italiano Giuseppe Simoni, genetista, con uno studio pubblicato su Lancet nel 1983 in collaborazione con il ginecologo Bruno Brambati.
Scopo L'esame dei villi coriali serve a valutare il cariotipo, cioè l'assetto cromosomico fetale, al fine di valutarne la normalità o, al contrario, la presenza di anomalie cromosomiche numeriche o strutturali. Tra le anomalie numeriche le pù importanti sono la trisomia dei cromosomi 13,18,21 e le alterazioni di numero dei cromosomi sessuali (monosomia X, sindrome di Klinefelter). Le anomalie cromosomiche strutturali, invece possono essere traslocazioni, (bilanciate, sbilanciate, o robertsoniane) delezioni, duplicazioni o inversioni.
Viene effettuato tra l'11ª e la 13ª settimana di gestazione.
Le indicazioni al prelievo dei villi coriali, già dai primi tempi, includevano, oltre allo studio del cariotipo e quindi le alterazioni numeriche e strutturali cromosomiche, anche le analisi enzimatiche e molecolari. La ricerca, diretta ad ottenere dalle cellule trofoblastiche i relativi cariotipi, risulta particolarmente allettante proprio in ragione della rapidità con cui si può ottenere il risultato citogenetico.
Le cellule trofoblastiche possiedono, infatti, un alto indice di crescita mitotica e permettono di eseguire colture a lungo termine spesso molto rapide (soli 5-7 giorni), periodo inferiore rispetto alle colture degli amniociti. La possibilità inoltre di poter esaminare direttamente le cellule prelevate in mitosi spontanea rende i termini temporali riducibili a soli 2-3 giorni.
L'esame viene proposto alle pazienti giudicate ad elevato rischio di anomalie cromosomicheindicazioni riportate dall'ACOG Practice Bulletin n° 27, maggio 2001, come ad esempio: donne di età superiore ai 35 anni aumentato spessore della translucenza nucale precedente figlio affetto da anomalia cromosomica genitori portatori di alterazioni cromosomiche (traslocazioni, inversioni, aneuploidie)
È utile accennare brevemente al perché la diagnosi molecolare sui villi coriali sta sempre più soppiantando le ricerche tradizionali sul liquido amniotico e sul sangue fetale.
I soggetti che vanno incontro alla diagnosi molecolare sono solitamente motivati da una rischio elevato per l'anomalia specifica, rischio solitamente valutato dal genetista sulla base dei parametri anamnestici e della familiarità.
Colei che ha un rischio elevato, e quindi una elevata possibilità di dover interrompere la gravidanza, richiede una diagnosi quanto più precoce possibile e la villocentesi risponde bene a tale requisito. Si tratta infatti della più precoce diagnosi prenatale ed inoltre, dal punto di vista strettamente laboratoristico, il poter disporre di una adeguata quantità di materiale di pertinenza fetale aiuta ulteriormente nell'abbreviare i tempi di diagnosi. Se si dovesse eseguire la stessa diagnosi sul liquido amniotico, si dovrebbe ricorrere ad una coltura cellulare preliminare che allungherebbe considerevolmente i tempi di analisi. Si tratta inoltre di diagnosi certe, che lasciano poco spazio ad errori interpretativi se ben condotte e su materiale puro e di buona qualità.
Attualmente, molte malattie geniche si studiano routinariamente sui villi coriali ed il ricorso per esse alle tradizionali tecniche, come la funicolocentesi, risulta del tutto da eliminare. La ricerca sui villi è infatti più precoce, sensibile, accurata e meno rischiosa.
Si prenda ad esempio la ricerca dell'anemia mediterranea. Fino a pochi anni or sono si eseguiva una funicolocentesi intorno alla 20º settimana di gravidanza, la diagnosi (ammesso che il prelievo fosse ben riuscito) si eseguiva con un'analisi morfologica e pertanto imprecisa. Il rischio di abortire era elevato e pure estremamente pesante dal punto di vista fisico e morale era il ricorso all'interruzione volontaria di gravidanza che, in caso di feto affetto, doveva avvenire intorno alla fine del sesto mese. Oggi, la ricerca delle mutazioni geniche sui villi coriali fornisce una diagnosi di certezza a sole 9-10 settimane di gestazione, con un rischio abortivo molto ridotto e con la eventualità di andare incontro ad una interruzione volontaria, per feto affetto, comunque entro il primo trimestre di gravidanza.
Attualmente sono entrate nel novero delle diagnosi prenatali di disordini mendeliani, tramite villi coriali, numerosissime patologie. Tra le più comuni si individuano la sordità congenita, la sindrome dell'X fragile e la fibrosi cistica; fra le centinaia di altre più rare, si segnalano la distrofia muscolare di Duchenne, le emoglobinopatie, la sindrome di Werdnig-Hoffmann.
Va tenuto comunque presente che, come detto in precedenza, il numero di queste si accresce quotidianamente e bisogna sempre mantenere stretti contatti con diversi Centri di biologia molecolare e genetica per poter sapere se sia possibile addivenire alla diagnosi di una di queste, anche se si trattasse di malattie rare e poco note.
Ricerca della paternità Tramite la villocentesi è possibile individuare con assoluta certezza il genitore biologico. Ciò avviene sia in casi di controversie legali e/o patrimoniali che, più raramente, in soggetti sottoposti a fecondazione in vitro dove vi sia il sospetto di uno scambio e/o di un errore di impianto dello zigote.
Cellule staminali I villi coriali contengono cellule staminali fetali multipotenti.
Oggi è anche possibile conservare ad uso autologo le cellule staminali presenti in un frammento dei villi coriali prelevati durante l'esecuzione della villocentesi.
Le cellule staminali dei villi coriali sono staminali fetali mesenchimali con prospettive applicative in medicina rigenerativa, avendo buone capacità riproduttive e ottima stabilità genomica. Queste cellule conservano intatte le proprie caratteristiche di staminalità durante tutta la gravidanza, tanto che possono essere prelevate anche da un frammento di placenta estratta dopo il parto.
Ricerca di agenti infettivi sui villi coriali Che le malattie infettive possano determinare malformazioni al feto è un concetto antico. Nel 1971 fu coniato il termine complesso TORCH, acronimo di Toxoplasmosi, Rosolia, Citomegalovirus, Herpesvirus, per descrivere una serie di infezioni che, trasmesse al feto in epoca prenatale, potevano determinare una anomalia.
La diagnosi prenatale si è quindi concentrata subito nel tentativo di riconoscere precocemente l'insorgere della malattia e dell'eventuale difetto.
Bisogna però informare con chiarezza sui confini della diagnosi prenatale di malattie infettive; a tale scopo, esistono alcuni principi culturali ai quali vale riferirsi prima di interpretare un protocollo di diagnosi prenatale di una eventuale malattia infettiva. Tale schema costituirà inoltre parte integrante del consenso informato a cui i genitori debbono essere introdotti prima di ogni procedura operativa: la presenza di una infezione nella madre non comporta affatto che questa debba necessariamente passare al feto, esistendo barriere naturali difensive. Ogni procedura invasiva deve tenere presente questo concetto, onde evitare il ricorso ad interventi inutili e talvolta pericolosi; la diagnosi prenatale invasiva, per quanto raffinata e sensibile, può darci solo informazioni in merito all'eventuale infezione fetale. Se questa abbia o meno determinato una anomalia nel feto non potrà mai stabilirlo con precisione ma solo in termini probabilistici. L'ecografia rimane pertanto l'unico vero strumento in grado di diagnosticare l'eventuale danno teratogeno, solo se questo si annovera tra quelli diagnosticabili con gli ultrasuoni. Ne consegue che bisogna assolutamente specificare con chiarezza che la diagnosi prenatale invasiva è finalizzata alla sola ricerca dell'agente infettivo e non alla possibile malformazione.
Il ricorso alla villocentesi ai fini della diagnosi di una infezione del compartimento fetale è procedura relativamente recente. Deve essenzialmente la sua introduzione alla possibilità, fornita dalla biologia molecolare, di riconoscere anche minime porzioni di materiale genico dell'agente infettante. Nei villi coriali infatti l'agente infettivo staziona a lungo, anche molto tempo dopo che l'infezione acuta sia oramai esaurita, ed esso non può essere riscontrato in altri compartimenti. La placenta è infatti un eccellente terreno di coltura ove la presenza dell'agente infettante può permanere anche dopo il parto.
La possibilità di eseguire ricerche sul DNA di agenti infettivi, particolarmente di natura virale, ha modificato sostanzialmente i protocolli tradizionali rendendo il ricorso alla funicolocentesi non più giustificabile sul piano diagnostico, poiché tardivo, impreciso e rischioso. La cosa non cambia in caso di infezioni sostenute da virus RNA, giacché la procedura si complica solo di un passaggio enzimatico preliminare, quello della transcriptasi inversa, volto a cambiare la sequenza di DNA.
Di enorme importanza è il ricorrere alla tecnica laboratoristica della reazione a catena della polimerasi (PCR), prima di ricercare con le sequenze specifiche, tramite ibridazione o altra tecnica genica, l'agente infettivo. La PCR infatti permette di amplificare più di un milione di volte le poche sequenze di DNA disponibile accelerando i tempi di indagine e rendendo la ricerca molecolare molto più sensibile.
L'isolamento del virus nei villi coriali può trarre in inganno nella sola evenienza che questo fosse andato a colonizzare solo la parte materna e non abbia forato il versante fetale della placenta. Tale evenienza è però più teorica che reale ed il riscontro di DNA infettivo sui villi coriali corrisponde, nella quasi totalità dei casi, al suo riscontro nel neonato. Cionondimeno tale ipotesi deve essere presa in considerazione nei casi dubbi ove la positività è borderline e la ricerca su altri tessuti fetali è negativa.
Microarray
Negli ultimi anni sono stati introdotti i microarray, utilizzati per permettere l'esame di un grande numero di prodotti genici simultaneamente.