Partendo dalla definizione di transgene ovvero un gene estraneo inserito in un qualsiasi organismo tramite operazioni di ingegneria genetica, intendiamo oggi con il termine transgenesi l'inserimento di un gene esogeno all'interno del genoma di un organismo bersaglio che funge da ospite; qui il transgene verrà espresso e sarà poi trasmesso alla progenie. Gli organismi transgenici spesso vengono indicati come Organismi Geneticamente Modificati (OGM): i due termini non sono sinonimi in quanto il termine transgenesi si riferisce all'inserimento, nel genoma di un dato organismo, di geni provenienti da un organismo di specie diversa. Sono invece definiti OGM anche quegli organismi che risultano da modificazioni che non prevedono l'inserimento di alcun gene (es. sono OGM anche gli organismi dal cui genoma sono stati tolti dei geni), così come gli organismi in cui il materiale genetico inserito proviene da un organismo "donatore" della stessa specie. In questo secondo caso alcuni studiosi parlano di organismi cisgenici.
La transgenesi è divenuta una tecnica molto utile per studiare i problemi dell'espressione genica e dello sviluppo dei mammiferi e per stabilire sistemi modello animali validi per le malattie dell'uomo. Un'applicazione interessante riguarda l'utilizzo della ghiandola mammaria per produrre con il latte proteine importanti a livello farmaceutico. Il latte è un fluido corporeo secreto, rinnovabile, prodotto in quantità consistenti e che si può raccogliere frequentemente senza nuocere all'animale. Una nuova proteina farmacologicamente attiva, presente all'interno della ghiandola mammaria e secreta con il latte, non dovrebbe inoltre avere effetti secondari sui normali processi fisiologici dell'animale transgenico e dovrebbe subire modificazioni post-traduzionali almeno strettamente compatibili con quelle dell'uomo. Infine la purificazione di una proteina dal latte, che contiene soltanto un piccolo numero di proteine diverse dovrebbe risultare relativamente semplice.
Origini della transgenesi
Le origini della transgenesi risalgono alla metà degli anni '70. Il primo esperimento è da ricondurre a Rudolf Jaenish che, con una micropipetta iniettò dei frammenti di DNA di SV40 nella cavità celomatica di un embrione di topo, dimostrando per la prima volta che si potevano ottenere dei mammiferi mutanti. I topi risultati da questo esperimento, erano mutanti, ma non potevano essere considerati transgenici.
Nel 1980 un nuovo gruppo di scienziati capeggiati da J.W. Gordon e da F.H. Ruddle misero a punto un nuovo esperimento: microiniettando del DNA ricombinante all'interno dello zigote dimostrando in seguito la trasmissione del transgene alla progenie. Gli animali ottenuti, sono stati per la prima volta denominati transgeni, e questa tecnica è comunemente adoperata ancora oggi.
Nel 1982 si assiste ad una nuova tappa fondamentale nella storia della transgenesi. Gli scienziati R.D. Palmiter e R.I. Brinster microiniettarono nei topi il gene dell'ormone della crescita. L'esperimento produsse dei ceppi di topi molto più grandi di quelli normali, dimostrando che era possibile modificare oltre al genotipo anche il fenotipo.
Metodi di transgenesi Esistono diversi metodi di transgenesi. I più semplici (utilizzati nella routine di laboratorio) consistono nell'uso di batteri e virus come vettori per il trasferimento genico. In parallelo sono stati sviluppati metodi alternativi per veicolare il DNA esogeno nell'ospite: metodi fisici, metodi chimici e l'endocitosi mediata da recettore. Metodi più complessi, ad esempio utilizzati nelle biotecnologie agrarie, comprendono le tecniche biobalistiche e la microiniezione. La transgenesi viene utilizzata nell'ingegneria genetica anche per la produzione di proteine eterologhe.
La transgenesi prevede diversi passaggi:
L'identificazione del gene di interesse; Costruzione del transgene. Esso prevede la realizzazione di una sequenza di nucleotidi che comprende la proteina di interesse a valle di un gene promotore (per consentire la trascrizione) e a monte di un terminatore di trascrizione. La scelta del promotore può dirigere l'espressione genica, che può essere limitata a una parte del corpo (foglie o radici, ghiandole mammarie...) o a una fase di sviluppo. In alcuni casi l'inserimento del transgene avviene attraverso l'uso di un vettore che può comprendere sequenze che regolano la replicazione. I vettori più conosciuti sono i plasmidi, piccoli anelli di DNA batterico. Le sequenze di controllo devono comprendere un promotore adatto per l'organismo ricevente e marcatori di selezione, che, ad esempio, possono essere geni per la resistenza agli antibiotici o erbicidi. La trasformazione degli organismi bersaglio avviene attraverso la tranfezione del DNA esogeno e di conseguenza l'integrazione delle informazioni genetiche all'interno della cellula ospite. L'introduzione del transgene o del vettore nel genoma della cellula, può essere ottenuta con diverse tecniche quali la permeabilizzazione delle membrane (nei batteri o lieviti), procedimenti meccanici (proiezione nell'ospite di microsfere di tungsteno o in oro recante il plasmide), introduzione di vettori biologici (utilizzando batteri per trasformare piante o per la trasformazione di altri batteri); è anche possibile introdurre il gene direttamente nella cella con microiniezione.
Uso di vettori plasmidici Le tecnologie attuali utilizzate per il trasferimento di geni attraverso la linea germinale di mammiferi richiede l'integrazione di DNA esogeno in un sito casuale all'interno del genoma ospite. Tuttavia, questo processo può generare effetti indesiderati, in quanto può posizionarsi non correttamente nel genoma dell'ospite o portare mutazioni nocive. Cromosomi artificiali di mammiferi sono buoni vettori per la produzione di transgeni, così come per la produzione di proteine cellulari e per applicazioni di terapia genica. Tutto questo perché hanno il vantaggio di:
avere al capacità di trasportare molecole di DNA di grandi dimensioni; avere la possibilità di replicare in parallelo col genoma dell'ospite, ma non integrato in esso; avere al capacità di venir trasmessi attraverso la linea germinale.
Il DNA satellite artificiale basato su cromosomi (SATAC) contiene: un'origine non virale di replicazione, i telomeri e il centromero. La transgenesi e il successivo monitoraggio della presenza del cromosoma artificiale prevede i seguenti passaggi:
Isolamento dei SATAC, citometria a flusso, e quindi raccolta per centrifugazione. Coltivazione degli embrioni (per esempio di topo). Esecuzione di una microiniezione dei SATAC nei pronuclei del topo, usando micropipette di vetro borosilicato. Estrazione totale del DNA genomico e amplificazione mediante PCR per valutare la presenza di Igromicina. Si procede poi con la colorazione della B-galattosidasi per verificare l'attività del gene lac Z (entrambi i geni sono presenti nel SATAC). Esecuzione, su embrioni coltivati su Colcemid (cellule bloccate in fase M), di un'ibridazione in situ fluorescente (FISH) con sonde di DNA satellite, lac Z e HPH.
Si è osservato che i cromosomi artificiali possono essere trasmessi, durante la mitosi, alla prole transgenica della persona, consentendo la sopravvivenza di una percentuale accettabile di individui. La creazione di topi transgenici con i SATAC permette applicazioni nella genomica funzionale e creazione di modelli animali di malattie umane.
Analisi dell'espressione del transgene Dopo che il transgene è stato introdotto nella cellula bersaglio, bisogna verificare se si esprime correttamente nel suo nuovo ambiente. Risulta pertanto opportuno analizzare i livelli di espressione del suo RNA e delle sue proteine. Per determinare l'attività trascrizionale del transgene si possono usare varie tecniche: Northern blot, RT PCR e ibridazione in situ. Invece per l'analisi dell'espressione del transgene a livello della traduzione si usano Western blot e immunoistochimica. Sono possibili variazioni nell'espressione del transgene in seguito al diverso sito di integrazione dello stesso. Ad esempio i primi topi che esprimevano il transgene per l'ormone della crescita, presentavano dimensioni del corpo raddoppiate rispetto ai topi wild type; i ricercatori hanno concluso affermando che la quantità di cDNA introdotta, sotto il controllo del promotore inducibile del gene della metallotioneina, era eccessiva e non regolata. Per questo è necessario inserire ulteriori regioni regolatrici specifiche per il gene in questione.
Esempi Applicativi Transgenesi nella manipolazione di organismi vegetali
Le piante rappresentano una risorsa importante per la produzione di proteine ricombinanti, in quanto esse richiedono bassi costi per essere coltivate, il passaggio dal laboratorio all'applicazione su larga scala è relativamente semplice ed inoltre i potenziali rischi di contaminazione da parte di agenti virali risultano piuttosto ridotti. Le cellule vegetali inoltre presentano vie di modificazione post-traduzionali simili a quelle animali, differenziandosi soltanto per piccole variazioni nelle vie di glicosilazione (Cabanes-Macheteau et al. 1999). Il loro impiego per la produzione di proteine ricombinanti umane da destinarsi all'uso terapeutico è quindi risultato di grande interesse.
Tra gli esempi più significativi ricordiamo l'ormone della crescita umano, prodotto come proteina di fusione con la nopalina sintasi di Agrobacterium in tabacco e girasole transgenici (Barta et al. 1986). Ciò è stato possibile sfruttando la capacità intrinseca dell'Agrobacterium di infettare le piante attraverso il trasferimento e la seguente integrazione nel DNA cromosomico di una regione del proprio plasmide Ti (induttore di tumore a livello del colletto della pianta). Attualmente il tabacco pur essendo la specie più utilizzata per questo tipo di studi, vegetali commestibili come il riso stanno acquistando grande interesse da parte dei ricercatori in quanto potrebbero essere direttamente consumati senza la necessità di purificare la proteina ricombinante prodotta.
Un classico esempio di transgenesi interessa proprio la produzione di riso geneticamente modificato. Il riso selvatico non produce vitamina A. Il primo passo è estrarre, da un altro vegetale, il gene che codifica per questa vitamina ( "futuro" transgene); successivamente quest'ultimo verrà introdotto nel genoma del riso selvatico affinché la vitamina venga prodotta. Dato che questo cereale è largamente consumato in Oriente, la realizzazione di un riso produttore di vitamina A preverrebbe gravi disturbi, come la cecità, legati alla mancanza di suddetta vitamina.
Transgenesi nella manipolazione di cellule embrionali Una Transgenesi applicata alla manipolazione di cellule embrionale prevede l'introduzione di DNA estraneo nelle cellule sopraddette totipotenti (cellule ES). Queste cellule sono prese all'interno della blastocisti. Il DNA estraneo viene introdotto nelle cellule ES utilizzando varie tecniche, le cellule trasfettate vengono poi reintrodotte in una blastocisti e re-impiantati in una donna. Con questa tecnica, i neonati sono chimere, alcuni, con materiale genetico originale mentre altri sono geneticamente modificati.
Dato che nel 1982 si è ottenuto in laboratorio il primo caso di un topo transgenico, oggi la produzione di animali transgenici aumenta ogni giorno, infatti si possono manipolare, oltre a cellule embrionali umane anche quelle di maiali, mucche, conigli, e pecore. La tecnica è svolta principalmente con microiniezione e avviene nel modo seguente:
nella prima fase, si isola un gran numero di uova fecondate; queste si ottengono sottoponendo le femmine(di qualsiasi specie) al trattamento ormonale per indurre superovulazione; nella seconda fase, gli zigoti sono trattati uno per uno e con una micropipetta avviene l'introduzione di una soluzione contenente DNA esogeno;