Krebsov ciklus, ciklus limunske kiseline ili ciklus trikarboksilnih kiselina (TCA ciklus) jedan je od temeljnih metaboličkih ciklusa kod stanica koje se koriste kisikom tijekom staničnog disanja. Kod aerobnih je organizama Krebsov ciklus ključni metabolički proces koji spaja puteve degradacije (katabolizma) ugljikohidrata, lipida (masti) i bjelančevina u ugljikov dioksid i vodu uz oslobađanje kemijske energije. Ciklus nosi ime po njemačko-britanskom kemičaru i nobelovcu Hansu Adolfu Krebsu.
Krebsov je ciklus amfibolički metabolički put s obzirom na to da sudjeluje i u degradaciji organskih molekula (katabolizam) i u biosintezi molekula (anabolizam). Najvažniji su metabolički putovi koji se vežu na Krebsov ciklus glikoliza i oksidativna dekarboksilacija piruvata koje mu prethode i oksidativna fosforilacija koja ga slijedi. Krebsov ciklus važan je i kao izvor prekursora aminokiselina (acetil CoA, α-ketoglutarat, sukcinil CoA, sukcinat, fumarat, oksalacetat).
Osnovne reakcije Krebsov se ciklus odvija u mitohondrijima eukariotskih stanica i u citoplazmi prokariotskih stanica. Katabolizam ugljikohidrata i masti stvara acetil-CoA, molekulu sastavljenu od jedne acetilne skupine vezane na koenzim A. Acetil-CoA je osnovni supstrat Krebsovog ciklusa. Dvije molekule acetil-CoA oslobađaju svoje acetilne skupine, koje se spajaju s oksalacetatom i formiraju limunsku kiselinu. Limunska kiselina prolazi kroz niz metaboličkih procesa, oslobađa dvije molekule ugljičnog dioksida (CO2) i regenerira se ponovo u oksalacetat koji je spreman za sljedeći ciklus. Najbitnije reakcije u energetskom smislu su formiranje molekule GTP, koja odmah regenerira jednu molekulu ATP, proizvodnja tri molekule NADH i jedne FADH2. Za ključne kemijske reakcije i enzime koje se odvijaju u Krebsovom ciklusu, kao i za njihove produkte vidi tablicu niže.
Reducirani kofaktori (NADH i FADH2) imaju ulogu prijelaznih molekula u procesima oksidacije i redukcije. U reduciranom stanju prenose elektrone od oksidiranih molekula iz samog Krebsovog ciklusa i glikolize do prve faze oksidativne fosforilacije, tzv. lanca prijenosa elektrona. Tada dolazi do oksidacije u NAD+ i FAD i davanja elektrona, koji će za vrijeme oksidativne fosforilacije bili iskorišteni za regeneriranje ATP iz ADP.
Konačna stehiometrijska formula svih reakcija je sljedeća:
Energija koja se dobije potpunom razgradnjom jedne molekule glukoze kroz tri faze staničnog disanja (glikoliza, Krebsov ciklus i oksidativna fosforilacija) je 36 molekula ATP-a. U stvarnosti se proizvede 38 molekula ATP-a, ali dvije su iskorištene za prijenos (aktivnim transportom) dviju molekula NADH proizvedenih putem glikolize iz citoplazme kroz membranu mitohondrija.
center|650px|Citric Acid Cycle (Hrvatski)
Supstrat Koenzim Enzim Vrsta reakcije Inibitori Aktivatori Produkt 1 oksalacetat acetil-CoA, voda citrat sintetaza kondenzacija citrat, NADH, sukcinil-CoA - citrat 2a citrat - akonitaza dehidracija - - cis-akonitat, voda 2b cis-akonitat voda hidracija isocitrat 3a izocitrat NAD+ izocitrat dehidrogenaza oksidacija NADH, ATP Ca2+, ADP oksalsukcinat, NADH 3b oksalsukcinat H+ dekarboksilacija α-ketoglutarat, CO2 4 α-ketoglutarat NAD+, CoA-SH α-ketoglutarat dehidrogenaza oksidativna dekarboksilacija NADH, sukcinil-CoA Ca2+ sukcinil-CoA, NADH, CO2 5 sukcinil-CoA GDP, fosfat sukcinil-CoA sintetaza fosforilacija - - sukcinat, GTP, CoA-SH 6 sukcinat FAD sukcinat deihdrogenaza oksidacija - - fumarat, FADH2 7 fumarat voda fumaraza hidracija - - L-malat 8 L-malat NAD+ malat deidrogenaza oksidacija - - oksalacetat, NADH
Stupnjevi Krebsovog ciklusa mini|Svaka podjedinica citrat sintetaze veže jednu molekulu oksalacetata (ljubičasto) i jednu acetil-CoA (bijelo). Reakcija 1: Citrat sintetaza mini|lijevo|ΔG'°=-31.4 kJ/mol Prvi enzim u Krebsovom ciklusu, citrat sintetaza katalizira reakciju kondenzacije acetil-CoA s oksalacetatom iz kojeg nastaje citrat (limunska kiselina). Enzim ima dvije strukturne podjedinice i svaka od njih sposobna je vezati oba supstrata za svoje aktivno mjesto. Enzim katalizira aktivaciju acetil-CoA, kako bi povećao afinitet prema oksalacetatu. Nakon povezivanja acetilne skupine na oksalacetat, tioesterna se grupa (CoA) odvaja hidrolizom kako bi se oslobodila limunska kiselina.
Jednadžba reakcije: Acetil-CoA + oksakacetat + H2O → citrat + CоА + H+
Reakcija je vrlo egzoergonska tj. oslobađa energiju (ΔG'°=-31.4 kJ/mol) što sprječava da reakcija teče u suprotnom smjeru. Limunska kiselina ima i ulogu reguliranja aktivnosti samog enzima, pošto djeluje kao kompetitivni inhibitor. Sposobnost inhibicije citrat sintetaze je jako bitna za reguliranje cijelog Krebsovog ciklusa, pošto ona funkcionira kao biokemijski pacemaker.C. Usher, J. Remington, P. Martin, G. Drueckhammer, A very short hydrogen bond provides only moderate stabilization of an enzyme-inhibitor complex of citrate synthase. In: Biochemistry 33, S. 7753.-7759., 1994.
mini|Struktura akonitaze Reakcija 2: Akonitaza mini|lijevo|ΔG'°=+6.3 kJ/mol Akonitaza katalizira izomerizaciju limunske kiseline (citrata) u izocitrat kroz prijelazno formiranje cis-akonitata. Citrat prolazi proces dehidracije C3 ugljika i stvaranje međuspoja cis-akonitata, koji se potom hidrira u C2 formirajući izocitrat. Reakcija može teći i u suprotnom smjeru, ali to se ne događa u Krebsovom ciklusu zbog zakona o djelovanju masa. Koncentracija citrata je 91%, međuspoja cis-akonitata je 3%, a izocitrata 6%. Reakcija stoga nepovratno teče prema izocitratu.
Jednadžba reakcije: citrat → cis-akonitat + H2O → izocitrat U aktivnom mjestu akonitaze nalazi se skupina željezo-sumpor koja veže supstrat, zajedno s određenim polarnim aminokiselinama. Prostorna struktura aktivnog mjesta dopušta samo vezivanje 1R,2S citrata, odbijajući suprotni izomer.H. Lauble, C. D. Stout: Steric and conformational features of the aconitase mechanism. In: Proteins 22, S. 1.-11., 1995
mini|Struktura isocitrat deidrogenaze Escherichie coli. Reakcija 3: Izocitrat dehidrogenaza
Mitohondrijska izocitrat dehidrogenaza je enzim koji je ovisan o NAD+, Mn2+ i/ili Mg2+. U početku enzim katalizira oksidaciju izocitrata u oksalsukcinat i proizvede jednu molekulu NADH od NAD+. Potom jedan bivalentni ion (Mn2+ ili Mg2+) veže kisik iz karboksilne skupine i povećava elektronegativnost tog dijela molekule. Dolazi do preraspodjele elektrona u molekuli, kidanja kemijske veze i oslobađanja karboksilne skupine. Dekarboksilacijom dolazi do formiranja α-ketoglutarata i oslobađanja jedne molekule CO2.Mesecar, A.D., Stoddard, B.L., Koshland Jr., D.E. Orbital steering in the catalytic power of enzymes: small structural changes with large catalytic consequences. Science v 277 202.-206., 1997.
Jednadžba reakcije: izocitrat + NAD+ → Oksalsukcinat + NADH + H+; Oksalsukcinat → α-ketoglutarat + CO2
mini|Katalitičko aktivno mjesto dihidrolipoamid suciniltransferaze, segmenta enzima α-ketoglutarat deihdrogenaze Escherichie coli Reakcija 4: α-ketoglutarat dehidrogenaza mini|lijevo|ΔG'°=-30.1 kJ/mol Pretvorba α-ketoglutarata u sukcinil-CoA od strane α-ketoglutarat dehidrogenaze događa se putem oksidativne dekarboksilacije. Reakcija predviđa dekarboksilaciju α-ketoglutarata i formiranje tioesterne veze s koenzimom A uz konačni produkt sukcinil CoA i oslobađanje CO2. Istovremeno dolazi do redukcije NAD+ u NADH.
Jednadžba reakcije: α-ketoglutarat + NAD+ + CоА-SH → sukcinil CоА + CO2 + NADH + H+
α-ketoglutarat dehidrogenaza je u biti kompleks sastavljen od tri različita enzima. Podjedinica E1 (2-ketoglutarat dehidrogenaza) i E2 (transsukcinilaza) vrlo su slične podjedinicama prisutnim u jednom drugom enzimu: piruvat dehidrogenazi. Podjedinica E3 je pak istovjetna podjedinici istog enzima. Najvjerojatnije jedan enzim evolutivno potječe od drugoga.Knapp, J.E., Carroll, D., Lawson, J.E., Ernst, S.R., Reed, L.J., Hackert, M.L. Expression, purification, and structural analysis of the trimeric form of the catalytic domain of the Escherichia coli dihydrolipoamide succinyltransferase. Protein Sci. v 9. 37.-48., 2000.
mini|Struktura sukcinil-CoA sintetaze izolirane iz svinjskog srčanog mišića Reakcija 5: Sukcinil CoA sintetaza mini|lijevo|ΔG°′ = -3.3 kJ mol-1 Sukcinil CoA je tioester visoke kemijske energije (njegova ΔG°′ hidrolize je -33.5 kJ mol-1, slična onoj ATP -30.5 kJ mol-1). Enzim sukcinil CoA sintetaza koristi ovu energiju za fosforilaciju purinskog nukleozid difosfata kao GDP u jednoj od ključnih reakcija stvaranja kemijske energije iz Krebsovog ciklusa.
Energija prisutna u tioesteru se jednostavno pretvori u energiju u obliku fosfatnih veza koje se kasnije koriste kao univerzalni izvor energije u gotovo svim endoergonskim metaboličkim procesima u cijelom organizmu. U prvom koraku reakcije enzim eliminira Koenzim A iz sukcinil CoA i nastaje međuspoj visoke energije sukcinil fosfat. Potom dolazi do primanja fosfata od jedne molekule histidina prisutom u aktivnom mjestu enzima koji oslobađa sukcinat kao konačni proizvod reakcije i formiranja fosfohistidina. Fosfohistidin odmah prebacuje fosfat na GDP pretvarajući ga u GTP. To je jedina reakcija u Krebsovom ciklusu kod koje dolazi do fosforilacije na nivou substrata.Fraser, M.E., James, M.N., Bridger, W.A., Wolodko, W.T. Phosphorylated and dephosphorylated structures of pig heart, GTP-specific succinyl-CoA synthetase. J.Mol.Biol. v 299 1325.-1339., 2000.
Jednadžba reakcije: sukcinat-CоА + Pi + GDP → sukcinat + GTP + CоА-SH Organizam ne koristi direktno GTP kao molekulu visoke energije (GTP ima ulogu signalne molekule). Njegova je uloga u Krebsovom ciklusu da posluži kao međuspoj koji prebacuje fosfatnu grupu na ADP kako bi se stvorio ATP. Tu reakciju katalizira enzim nukleozid difosfokinaza.
U završnim fazama Krebsovog ciklusa dolazi do preraspodjele molekula s četiri atoma ugljika do ponovne regeneracije oksalacetata. Da bi to bilo moguće, metilna grupa prisutna na sukcinatu mora doživjeti konverziju u karbonilnu grupu. Konverzija nastaje u tri prijelaza: prva oksidacija, pa hidracija, potom druga oksidacija. Navedeni prijelazi, osim što regeneriraju oksalacetat, omogućavaju „izvlačenje“ dodatne kemijske energije putem nastanka flavin adenin FADH2 i NADH.
mini|Struktura enzimskog kompleksa sukcinat dehidrogenaze i kompleksa II lanca prijenosa elektrona Escherichia coli. Reakcija 6: Sukcinat dehidrogenaza mini|lijevo|ΔG'°=0 kJ/mol Prvu reakciju oksidacije katalizira enzimski kompleks sukcinat dehidrogenaze, jedini enzim iz ciklusa koji ima FAD kao primatelja vodika umjesto NAD+. FAD je kovalentno vezan za enzim, preko jedne molekule histidina. Enzim koristi FAD kao primatelj vodika, pošto reakcija ne razvija dovoljno slobodne energije da reducira NAD+. Enzim katalizira oksidaciju sukcinata u fumarat.V. Yankovskaya, R. Horsefield, S. Tornroth, C. Luna-Chavez, H. Miyoshi, C. Leger, B. Byrne, G. Cecchini, S. Iwata: Architecture of succinate dehydrogenase and reactive oxygen species generation. In: Science 299, S. 700.-704., 2003.
Jednadžba reakcije: sukcinat+ FAD → fumarat + FADH2
Enzimski sustav sukcinat dehidrogenaze je jedini iz cijelog ciklusa koji se nalazi unutar mitohondrijske membrane. Enzim se nalazi u toj poziciji pošto ulazi i u metabolički put lanca prijenosa elektrona (u kojem nosi naziv kompleks II). Nakon prijelaza na FAD, enzim ubacuje elektrone direktno u lanac prijenosa elektrona, koji je prvi dio oksidativne fosforilacije. To je moguće upravo zbog stabilne veze između enzima i samog kofaktora FAD.
mini|Struktura fumaraze kvasca Saccharomyces cerevisiaeWeaver, T., Lees, M., Zaitsev, V., Zaitseva, I., Duke, E., Lindley, P., McSweeny, S., Svensson, A., Keruchenko, J., Keruchenko, I., Gladilin, K., Banaszak, L. Crystal structures of native and recombinant yeast fumarase. J.Mol.Biol. v 280 431.-442., 1998. Reakcija 7: Fumaraza mini|lijevo|ΔG'°=-3.8 kJ/mol