miniatura|Unha célula en metafase positiva para o rearranxo cromosómico BCR/ABL detectado usando FISH. A citoxenética é esencialmente unha rama da xenética, pero que forma parte tamén da bioloxía celular/citoloxía, que estuda o número, morfoloxía e anormalidades dos cromosomasNational Human Genome Research Institute - NIH CytogeneticsNational Cancer Institute - NIH Cytogenetics e o seu comportamento na célula, especialmente durante a mitose e a meiose. As técnicas utilizadas inclúen a determinación de cariotipos, a análise do bandeado G dos cromosomas ou outras técnicas de bandeado, así como as técnicas de citoxenética molecular como a hibridación fluorescente in situ (FISH) e a hibridación xenómica comparativa (CGH).
Historia
Os primeiros tempos
Os cromosomas observáronse primeiro en células vexetais por Karl Wilhelm von Nägeli en 1842. O seu comportamento en células animais, concretamente de píntega, foi descrito por Walther Flemming, o descubridor da mitose, en 1882. O nome cromosoma foi acuñado polo anatomista alemán, von Waldeyer en 1888.
A seguinte etapa tivo lugar despois do desenvolvemento da xenética a inicios do século XX, cando se apreciou que o conxunto de cromosomas (o cariotipo) portaban os xenes. Levitsky parece que foi o primeiro en definir o cariotipo como a aparencia fenotípica dos cromosomas somáticos, en contraposición aos seus contidos xénicos.Levitsky G.A. 1924. The material basis of heredity. State Publication Office of the Ukraine, Kiev. [in Russian] A investigación sobre o cariotipo humano tardou moitos anos en establecer a cuestión máis básica: cantos cromosomas contén a dotación diploide dunha célula humana normal?Kottler M. 1974. From 48 to 46: cytological technique, preconception and the counting of the human chromosomes. Bull. Hist. Med. 48, 465-502. En 1912, Hans von Winiwarter informou que había 47 cromosomas nas espermatogonias e 48 nas ovogonias, polo que a súa conclusión foi que os humanos tiñamos un sistema de determinación do sexo XX/X0.von Winiwarter H. 1912. Études sur la spermatogenese humaine. Arch. biologie 27, 93, 147-9. Painter en 1922 non estaba seguro de se o número diploide humano era de 46 ou de 48, e ao principio inclinábase máis por 46.Painter T.S. 1922. The spermatogenesis of man. Anat. Res. 23, 129. Modificou despois esta opinión a 48 (o cal é incorrecto) e insistiu que os humanos tiñan un sistema de determinación do sexo XY (XX en mulleres e XY en homes, o cal é correcto).Painter T.S. 1923. Studies in mammalian spermatogenesis II. The spermatogenesis of man. J. Exp. Zoology 37, 291-336. Considerando as técnicas básicas que podía usar, estes resultados foron moi salientables. Nos libros de ciencia, o número de cromosomas humanos permaneceu como 48 durante uns trinta anos. Foi necesario a aparición de novas técnicas para corrixir este erro. Joe Hin Tjio traballando no laboratorio de Albert Levan lab foi o responsable de utilizar o seguinte novo procedemento:
Usou células en cultivo. Pretratou as células cunha solución hipotónica, que fai que inchen e espallen os cromosomas. Fixo que se detivese a mitose na metafase usando unha solución de colchicina. Esmagou a preparación nun portaobxectos forzando os cromosomas a colocarse nun só plano. Recortou unha fotomicrografía dos cromosomas e dispuxo os resultados creando un cariograma imposible de discutir.
Non obstante, ata 1956 non se aceptou xeneralizadamente que o cariotipo humano tiña 46 cromosomas.Tjio J.H & Levan A. 1956. The chromosome number of man. Hereditas 42, 1-6.Hsu T.C. Human and mammalian cytogenetics: a historical perspective. Springer-Verlag, N.Y. Encyclopædia Britannica, The Human Chromosome Os grandes simios teñen 48 cromosomas. O cromosoma 2 humano orixinouse pola fusión de dous cromosomas ancestrais que tiñan os antepasados comúns de homínidos e simios, reducindo este número a 46 na liñaxe dos homínidos. Evolution Pages, Chromosome fusion
Aplicacións en bioloxía
Traballos de McClintock sobre o millo
Barbara McClintock empezou a súa carreira como citoxenetista do millo. En 1931, McClintock e Harriet Creighton demostraron que a recombinación citolóxica de cromosomas marcados correlacionábase coa recombinación de trazos xenéticos (xenes). McClintock, cando estaba na Institución Carnegie, continuou estudos previos sobre os mecanismos da rotura e fusión de cromosomas no millo. Identificou un evento particular de rotura cromosómica que sempre ocorría no mesmo locus do cromosoma 9 do millo, que ela denominou locus "Ds" ou de "disociación".Ravindran, Sandeep. "Barbara McClintock and the discovery of jumping genes." 109.50 20198- 20199. Proceedings of the National Academy of the United States of America. Web. 08 Apr 2013. <http://www.pnas.org.pallas2.tcl.sc.edu/content/109/50/20198.full>. McClintock continuou a súa carreira en citoxenética estudando a mecánica e herdanza de cromosomas rotos e en anel (circulares) do millo. Durante os seus traballos citoxenéticos, McClintock descubriu os transposóns, un descubrimento que finalmente faría que se lle outorgase o Premio Nobel en 1983.
Poboacións naturais de Drosophila Na década de 1930, T. Dobzhansky e os seus colaboradores recolleron exemplares de Drosophila pseudoobscura e D. persimilis das súas poboacións silvestres en California e estados veciños. Usando a técnica de PainterPainter T.S. 1933. A new method for the study of chromosome rearrangements and the plotting of chromosome maps. Science 78: 585-586. estudaron os cromosomas politénicos deses dípteros e descubriron que as poboacións silvestres eran polimórficas para as inversións cromosómicas. Todas as moscas tiñan aspecto similar fose cal fose a inversión que levasen: este é un exemplo de polimorfismo críptico.
Acumuláronse rapidamente evidencias que mostraban que a selección natural era a responsable disto. Usando un método inventado por L'Héritier e Teissier, Dobzhansky criou poboacións destas moscas en gaiolas de poboación, as cales lles permitían alimentarse, cruzarse e ser mostreadas, pero non lles permitían escapar. Isto tiña a vantaxe de eliminar a migración como unha posible explicación dos resultados. Os continxentes de moscas que contiñan inversións a unha frecuencia inicial coñecida poden ser mantidos en condicións controladas. Atopouse que os diversos tipos de cromosomas non flutuaban ao chou, como se fosen neutros selectivamente, senón que se axustaban a certas frecuencias ás cales quedaban estabilizados. Na época en que Dobzhansky publicou a terceira edición do seu libro en 1951Dobzhansky T. 1951. Genetics and the origin of species. 3rd ed, Columbia University Press, Nova York. estaba convencido de que os morfos cromosómicos estaban sendo mantidos na poboación pola vantaxe selectiva dos heterocigotos, igual que na maioría dos polimorfismos.Dobzhansky T. 1970. Genetics of the evolutionary process. Columbia University Press N.Y.[Dobzhansky T.] 1981. Dobzhansky's genetics of natural populations. eds Lewontin RC, Moore JA, Provine WB and Wallace B. Columbia University Press N.Y.
Lilas e ratos
As lilas son organismos moi axeitados para o exame citolóxico da súa meiose, xa que os seus cromosomas son grandes e cada etapa morfolóxica da meiose pode identificarse microscopicamente doadamente. Hotta et al. presentaron probas da existencia dun padrón común de corte de amosegas no ADN e posterior síntese de reparación nas células meióticas de roedores machos e de lilas durante as etapas de cigoteno–paquiteno da meiose cando se supoñía que ocorría o sobrecruzamento. A presenza dun padrón común entre organismos tan afastados filoxeneticamente como son un animal e unha planta, fixo que os autores chegasen á conclusión de que a organización do sobrecruzamento meiótico, polo menos en eucariotas superiores, ten probablemente unha distribución universal.
Anormalidades cromosómicas humanas e aplicacións médicas miniatura|Tanslocación Filadelfia t(9;22)(q34;q11.2) vista na leucemia mielóxena crónica.
Conforme melloraron os procedementos que permitían unha fácil numeración dos cromosomas, fixéronse rapidamente descubrimentos sobre cromosomas aberrantes ou de casos de número anormal de cromosomas. Nalgúns trastornos xenéticos, como a síndrome de Down, a citoxenética revelou a natureza do defecto cromosómico: unha trisomía "simple". As anormalidades que se orixinan por fenómenos de non-disxunción poden tamén causar que se formen células con aneuploidías (adicións ou delecións de cromosomas enteiros) nun dos pais ou no feto. En 1959, J. LejeuneLejeune J, Gautier M, Turpin MR. Etude des chromosomes somatiques de neuf enfants mongoliens. C R Acad Sci (París) 1959;248:1721-2. descubriu que os pacientes de síndrome de Down tiñan xeralmente unha copia extra do cromosoma 21. A síndrome de Down tamén se denomina trisomía 21.
Outras anormalidades numéricas descubertas afectaban os cromosomas sexuais. Unha muller que ten un só cromosoma X, a cal en total ten 45 cromosomas, padece a síndrome de Turner, mentres que un cromosoma X extra nun home, que en total terá 47 cromosomas, causa a síndrome de Klinefelter. Moitas outras combinacións de cromosomas sexuais son compatibles coa vida, como a XXX, XYY e XXXX. A capacidade dos mamíferos de toleraren as aneuploidías nos cromosomas sexuais débese a que os cromosomas X poden desactivarse (forman os corpos de Barr), o cal é necesario nas femias para compensaren o feito de teren dúas copias dese cromosoma. Non todos os xenes dese cromosoma X son inactivados, razón pola cal se observa un efecto fenotípico nos individuos con cromosomas X extra.
A trisomía 13 foi asociada coa síndrome de Patau e a trisomía 18 coa síndrome de Edwards.
En 1960, Peter Nowell e David HungerfordNowell PC, Hungerford DA. A minute chromosome in human chronic granulocytic leukemia. Science 1960;132:1497-1501. descubriron un pequeno cromosoma especial nos leucocitos de pacientes de leucemia mielóxena crónica. Este cromosoma anormal foi denominado cromosoma Filadelfia, xa que ambos os científicos estaban traballando en Filadelfia, Pensilvania, onde o atoparon. Trece anos máis tarde, co desenvolvemento de técnicas máis avanzadas, Janet Rowley demostrou que ese cromosoma era resultado dunha translocación cromosómica entre os cromosomas 9 e 22. A identificación do cromosoma Filadelfia por citoxenética serve para o diagnóstico da leucemia mielóxena crónica.
Aparición das técnicas de bandeado miniatura|250px|Cariotipo masculino humano.
A finais da década de 1960, Torbjörn Caspersson desenvolveu unha técnica de tinguidura con quinacrina fluorescente (bandeado Q), que orixinaba padróns de bandas tinguidas únicas para cada par cromosómico. Isto permitiu que os pares cromosómicos de igual forma e tamaño se puidesen diferenciar polo seu distinto padrón de bandas horizontais. Os padróns de bandeado utilízanse agora para dilucidar os puntos de rotura e os cromosomas constituíntes implicados nas translocacións cromosómicas. As delecións e inversións nun determinado cromosoma poden tamén ser identificadas e descritas con máis precisión usando unha nomenclatura de bandas estandarizada. O bandeado G (que utiliza tripsina e tinguidura Giemsa/ Wright) foi desenvolvido case ao mesmo tempo a inicios da década de 1970 e permite a visualización de padróns de bandas usando un microscopio de campo brillante.
Os diagramas que identifican os cromosomas baseados nos padróns de bandas coñécense como idiogramas. Estes mapas convertéronse en básicos nos campos oncolóxico e prenatal para usar a citoxenética no laboratorio clínico, onde a realización de cariotipos permite observar as alteracións cromosómicas. As técnicas ampliáronse para permitir o cultivo de amniocitos libres recollidos do líquido amniótico, e técnicas para todos os tipos de cultivos que permiten unha mellor resolución das bandas.
Os comezos da citoxenética molecular