miniatura|260x260px|MicroCal. VP-ITC nunha caixa de luvas. En termodinámica química, a calorimetría isoterma de titulación ou calorimetría isotérmica de titulación (CIT ou ITC na literatura inglesa) é unha técnica física usada para determinar os parámetros termodinámicos das interaccións nunha solución. A CIT é a única técnica con capacidade de caracterizar completamente os perfís termodinámicos e cinéticos dunha interacción molecular ao determinar simultaneamente as constantes de unión (), a estequiometría da reacción (), a entalpía (), a enerxía libre de Gibbs () e a entropía () cun só experimento. Consta de dúas células que están encerradas nunha cuberta adiabática.
Os compostos que se van estudar sitúanse na célula de mostras, mentres que a outra célula, a célula de referencia, utilízase como control e contén o tampón no cal a mostra se disolve. A técnica cuantifica a calor liberada ou absorbida durante o proceso de unión ao engadir incrementalmente un reactivo (por medio dunha xeringa) a outro (na célula de mostras) mentres se mantén a temperatura e a presión constantes. Os aparellos sensibles á calor na CIT detectan as variacións de temperatura entre as dúas células, transmitindo esta información aos quentadores que se axustan en consecuencia para restaurar o equilibrio térmico entre as células. Esta enerxía convértese en entalpía de unión usando a información sobre as concentracións dos reactivos e o volume da célula. Comparado con outros calorímetros, a CIT non require ningún corrector, xa que non hai intercambio de calor entre o sistema e o ambiente. A CIT é tamén moi sensible e ten un rápido tempo de resposta e vantaxes polos seus modestos requirimentos de mostra. Aínda que a calorimetría de varrido diferencial pode tamén proporcionar información directa sobre a termodinámica das interaccións de unión, a CIT ofrece a capacidade engadida de cuantificar a termodinámica da unión de ións metálicos a proteínas.
Historia da CIT
A historia da CIT pode remontarse ata a década de 1930 cando se utilizou a calorimetría isoterma para o estudo de reaccións químicas. En 1965 Christensen e Izatt introduciron a calorimetría de titulación como método para deteminar simultaneamente a constante de equilibrio e a entalpía. As técnicas de CIT foron desenvolvidas por H. D. Johnston en 1968 como parte da súa tese de doutoramento na Universidade de Brigham Young, e foron consideradas unha área especializada ata que a introduciu comercialmente MicroCal Inc. en 1988. En 1978, Beaudette e Langerman realizaron un dos primeiros estudos de unión calorimétricos usando un calorímetro de titulación isoperibol de pequeno volume e unha década despois, en 1989, Wiseman, Williston, Brandts e Lin demostraron a súa aplicación en sistemas biolóxicos, marcando o comezo da calorimetría de titulación como feramenta valiosa para o estudo dos equilibrios biolóxicos. Orixinalmente, a CIT era principalmente usada para estudar a unión de pequenas moléculas (como os compostos medicinais) a macromoléculas máis grandes (proteínas, ADN etc.) nun ambiente sen etiquetaxe. Agora as súas aplicacións son máis amplas, grazas ás melloras modernas, o que fixo posible medir efectos da calor de tan só 0,1 μcal (0,4 μJ) e determinar constantes de unión (K) elevadas de ata 108–109 M−1.
Medicións termodinámicas miniatura|400x400px|O termograma CIT; o panel superior esuerdo mostra a curva de titulación; o panel inferior esquerdo mostra o termograma CIT correspondente; o panel da dereita mostra o termograma CIT con diferentes valores c. A CIT (ou ITC) é unha técnica cuantitativa que pode determinar a afinidade de unión (), entalpía de reacción (), e estequiometría de unión () da interacción entre dúas ou máis moléculas en solución. Isto conséguese medindo as entalpías dunha serie de reaccións de unión causadas por inxeccións dunha solución dunha molécula a unha célula de reacción que contén unha solución doutra molécula. Os valores de entalpía represéntanse graficamente en relación coas razóns molares resultantes das inxeccións. A partir da gráfica determínanse a entalpía da reacción molar , a constante de afinidade () e a estequiometría polo axuste de curvas. Poden determinarse o cambio de enerxía libre de Gibbs da reacción () e o cambio de entropía () usando as relacións:
(onde é a constante dos gases e é a temperatura absoluta).
Para medidas exactas da afinidade de unión, a curva do termograma debe ser sigmoidal. Unha curva sigmoidal de moita pendente indica unha unión forte, mentres que se ten menos pendente a unión é máis débil. O perfil da curva determínase polo valor c, que se calcula usando a ecuación:
onde é a estequiometría da unión, é a constante de asociación e é a concentración da molécula na célula.Quick Start: Isothermal Titration Calorimetry (ITC) (2016). TA Instrument. New Castle, DE.VP-ITC Instruction Manual (2001). Microcal Inc., Northampton, MA. O valor c debe estar entre 1 e 1000, idealmente entre 10 e 100. En termos de afinidade de unión, sería aproximadamente desde ~ dentro do rango límite.Stevenson, M. J. (2016) Thermodynamic studies of Cu(I) and other d10 metal ions binding to proteins in the copper homeostasis pathway and the organomercurial detoxification pathway. Dartmouth College. Se non está entre o rango mencionado, os valores termodinámicos obtidos do experimento son menos robustos para facer unha interpretación.
Medidas instrumentais miniatura|400x400px|Esquema dun instrumento de CIT que mostra a célula de referencia, a célula de mostras e a inxección do ligando. Un calorímetro de titulación isoterma está composto por dúas células idénticas feitas dun material condutor térmico moi eficiente e quimicamente inerte, como a aliaxe Hastelloy ou ouro, rodeado por unha cuberta adiabática. Neste dispositivo, unha das células, a célula de mostras, contén a solución dun reactivo, e a outra célula, a célula de referencia, está chea cun tampón ou con auga.
O segundo reactivo, que ten unha maior concentración que o primeiro, sitúase nunha xeringa e inxéctase gradualmente na célula de mostras en pequnas alicuotas durante o proceso de titulación. Este proceso está semiautomatizado e os circuítos termopila/termopar sensibles usados para detectar as diferenzas de temperatura entre a célula de referencia (chea con tampón ou con auga) e a célula de mostras que contén a macromolécula. Antes da adición do ligando, aplícase unha corrente constante (<1 mW) á célula de referencia. Isto dirixe un circuíto de retroalimentación, activando un quentador localizado na célula de mostras. Durante o experimento, o ligando titúlase na célula de mostras en alícuotas coñecidas con precisión, causando que se capte ou desprenda calor (dependendo da natureza da reacción). As medidas constan de entradas de corrente dependentes do tempo que cómpren para manter temperaturas iguais entre as células de mostras e de referencia.
miniatura|Titulación paso a paso dun reactivo (na xeringa) noutro reactivo (na célula de mostras). Nunha reacción exotérmica, a temperatura na célula de mostras aumenta coa adición do ligando. Isto causa que a potencia de retroalimentación da célula de mostras decreza (lembremos: aplícase unha potencia de reference á célula de referencia) para manter unha temperatura igual entre as dúas células. Nunha reacción endotérmica ocorre o contrario; o circuíto de retroalimentación incrementa a potencia para manter unha temperatura constante (operación isotérmica).
As observacións represéntanse graficamente tendo en conta a corrente necesaria para manter a célula de referencia e a célula de mostras a temperatura idéntica fronte ao tempo. Como resultado, os datos brutos do experimento consisten nunha serie de picos de fluxo de calor, e cada pico corresponde a unha inxección de ligando. Eses picos/pulsos de fluxo de calor son integrados con respecto ao tempo, dando a calor total intercambiado por inxección. Integrando cada pico desde a liña base, obtense a calor total asociada con cada inxección, incluíndo tanto as contribucións específicas da reacción coma as non relacionadas coa reacción. O padrón deses efectos de calor en función da razón molar [ligando]/[macromolécula] poden analiarse despois para dar os parámetros termodinámicos da interacción estudada.
Procedementos experimentais miniatura|381x381px|Un exemplo de configuración de parámetros experimentais para CIT, incluíndo o número de inxeccións, volume da inxección inicial, volumes das inxeccións seguintes, temperatura, potencia de referfencia, velocidade de axitación, atraso inicial e período de filtración. Para medir con precisión os parámetros termodinámicos usando a CIT, deben seguirse certos procedementos que implican a instrumentación, a configuración de parámetros, cargado da mostra, selección do tampón e limpeza dos instrumentos. Para obter un resultado óptimo, a cada inxección debe dárselle o tempo suficiente para que se chegue ao equilibrio da reacción. Para obter boas medidas adoita ser necesaria a desgasificación da mostra, xa que a presenza de burbullas de gas dentro da mostra produce gráficas de datos anormais nos resultados rexistrados. O experimento enteiro ten lugar baixo o control dun computador.
A titulación directa realízase normalmente con CIT para obter os datos termodinámicos, unindo os dous compoñentes da reacción directamente. Porén, moitas das reacción químicas e interaccións de unión poden ter unha maior afinidade de unión que a que é conveniente coa ventá c. Para solcionar esta limitación da ventá c e as condicións para certas interaccións de unión, poden utilizarse varios métodos de titulación. Nalgúns casos, o problema pode resolverse simplemente facendo unha titulación inversa de cambio de mostras entre a xeringa de inxección e a célula de mostras, dependendo do mecanismo de unión. Porén, o proceso de introducir un ligando nunha macromolécula é distinto do proceso de engadir macromoléculas a un ligando. Aínda que o equilibrio de unión non cambia tanto na titulación directa coma na inversa, a ruta ao equilibrio e os estados de unión accesibles varían, especialmente cando unha molécula posúe moitos sitios de unión para a outra. A maioría das unións de alta ou baixa afinidade requiren quelación ou titulación competitiva. Este método faise cargando a solución do complexo pre-unión na célula de mostras e quelando un dos compoñentes cun reactivo de maior afinidade de unión observada dentro da ventá c conveniente.
Para asegurar unha estabilidade óptima do instrumento da CIT, este debería conectarse polo menos un día antes do seu uso. As mostras idealmente deberían ser pre-equilibradas a aproximadamente 2 °C por debaixo da temperatura experimental buscada para reducir o tempo de estabilización despois de cargar, aínda que empezar á temperatura experimental exacta é tamén unha opción. Para a limpeza dos instrumentos, a célula de mostras debería lavarse co tampón experimental e secarse ao baleiro, e calquera resto de solución que puidese quedar debería ser eliminada manualmente cunha xeringa. Entón, a célula de mostras énchese coa solución experimental e a célula de referencia con auga de alta pureza ou co mesmo tampón. Para impedir a contaminación do aire, utiízanse as xeringas de Hamilton impermeables aos gases, asegurando que a agulla está situada preto do fondo da célula de mostras antes de deitar o líquido lentamente. Os parámetros experimentais como o número de inxeccións, volume da inxección inicial, volumes das inxeccións seguintes, temperatura, potencia de referencia, velocidade de axitación, espazado, atraso inicial e período de filtración debería axustarse de acordo do estudo específico que se vai realizar.