400px|miniatura|Os electroferogramas utilízanse comunmente para secuenciar porcións dun xenoma. miniatura|250px|Imaxe dos 46 cromosomas que constitúen o xenoma diploide humano masculino. Non se mostra o cromosoma mitocondrial.
A secuenciación do xenoma completo ou do/de xenoma total ou enteiro é o proceso de determinar a secuencia completa ou case completa do ADN do xenoma dun organismo nun só experimento. Isto supón secuenciar todo o ADN dos cromosomas dun organismo e tamén o ADN mitocondrial e, nas plantas e algas, o ADN do cloroplasto.
A secuenciación do xenoma completo utilizouse maiormente como ferramenta de investigación, pero tamén se introduciu nas clínicas médicas en 2014. No futuro da medicina personalizada os datos de secuenciación do xenoma completo poden ser importantes ferramentas para guiar a intervención terapéutica. A ferramenta da secuenciación de xenes a nivel de polimorfismos dun só nucleótido (SNP) tamén se utiliza para localizar variantes funcionais en estudos de asociación e mellorar o coñecemento dispoñible para os investigadores interesados en bioloxía evolutiva, e, por tanto, pode servir de base para predicir a susceptibilidade a enfermidades e a resposta a fármacos.
A secuenciación do xenoma completo non debería confundirse co perfil de ADN, que só determina a probabilidade de que o material xenético proceda dun determinado individuo ou grupo, e non contén información adicional sobre relacións xenéticas, orixe ou susceptibilidade a doenzas específicas.Kijk magazine, 1 de xaneiro de 2009 Ademais, a secuenciación de xenoma completo non debería confundirse con métodos que secuencian subconxuntos específicos do xenoma, os cales incluirían a secuenciación do exoma completo (1-2% do xenoma total) ou o xenotipado de SNP (<0,1% do xenoma). En 2017 non había ningún xenoma completo secuenciado de mamíferos, incluíndo os humanos. Entre o 4% e o 9% do xenoma humano, principalmente ADN satélite, non foi aínda secuenciado.
Historia
miniatura|esquerda|O primeiro xenoma bacteriano completo de bacteria secuenciado foi o de Haemophilus influenzae. miniatura|O verme Caenorhabditis elegans foi o primeiro animal do que se secuenciou o xenoma completo. miniatura|esquerda|O xenoma completo da mosca Drosophila melanogaster secuenciouse en 2000. miniatura|Arabidopsis thaliana foi a primeira planta á que se lle secuenciou o xenoma. miniatura|O xenoma do rato de laboratorio Mus musculus publicouse en 2002. miniatura|esquerda|Tardouse 10 anos coa intervención de 50 científicos de todo o mundo en secuenciar o xenoma de Elaeis guineensis (de onde se obtén o aceite de palma). Este xenoma foi especialmente difícil de secuenciar porque ten moitas secuencias repetidas, que son difíciles de organizar.
Os métodos de secuenciación do ADN usados nas décadas de 1970 e 1980 eran manuais, por exemplo a secuenciación de Maxam e Gilbert e a secuenciación de Sanger. Con estas técnicas secuenciáronse varios xenomas de bacteriófagos e de virus animais, pero o paso a métodos de secuenciación automatizados e máis rápidos na década de 1990 facilitou a secuenciación de xenomas bacterianos e eucariotas máis grandes.
O primeiro organismo do que se secuenciou o xenoma completo foi a bacteria Haemophilus influenzae en 1995. Despois diso, secuenciáronse primeiro os xenomas doutras bacterias e algunhas arqueas, principalmente debido ao seu pequeno tamaño do xenoma. H. influenzae ten un xenoma de 1.830.140 pares de bases de ADN. A diferenza delas, os eucariotas, tanto os unicelulares coma os multicelulares como Amoeba dubia e os humanos (Homo sapiens), respectivamente, teñen xenomas moito máis grandes (ver paradoxo do valor C). Amoeba dubia ten un xenoma de 700 miles de millóns de pares de nucleótidos distribuídos en miles de cromosomas. Os seres humanos conteñen menos pares de nucleótidos (uns 3,2 miles de mllóns en cada célula xerminal, aínda que o tamaño exacto do xenoma humano está aínda sendo revisado) que A. dubia, aínda que o tamaño do seu xenoma supera en moito ao dunha bacteria.
Os primeiros xenomas bacterianos e arqueanos, incluíndo o de H. influenzae, foron secuenciados por medio da secuenciación de escopeta. En 1996 secuenciouse o primeiro xenoma eucariota, o do lévedo Saccharomyces cerevisiae. Este lévedo é un organismo modelo en bioloxía e ten un xenoma de só uns 12 millóns de pares de nucleótidos, e foi o primeiro eucariota unicelular do que se secuenciou o xenoma completo. O primeiro eucariota multicelular e animal que foi completamente secuenciado foi o verme nematodo Caenorhabditis elegans en 1998. Os xenomas eucariotas secuéncianse por medio de varios métodos, como a secuenciación de escopeta de fragmentos curtos de ADN e a secuenciación de clons de ADN máis grandes procedentes de bibliotecas de ADN como as de cromosomas artificiais bacterianos (BACs) e cromosomas artificiais de lévedos (YACs).
En 1999, publicouse a secuencia de ADN enteira do cromosoma 22 humano, que é o noso autosoma máis curto. No ano 2000, secuenciouse o segundo xenoma animal e segundo invertebrado (e primeiro insecto), que foi o da mosca do vinagre Drosophila melanogaster, un organismo modelo moi utilizado en investigación experimental. O primeiro xenoma de planta, o do organismo modelo Arabidopsis thaliana, secuenciouse en 2000. En 2001, publicouse un borrador do xenoma humano completo. A secuenciación do xenoma do rato de laboratorio Mus musculus completouse en 2002.
En 2004, o Proxecto Xenoma Humano publicou unha versión incompleta do xenoma humano. En 2008, un grupo en Leiden, Países Baixos, informou da secuenciación do primeiro xenoma humano feminino (Marjolein Kriek).
Actualmente xa foron secuenciados miles de xenomas de forma parcial ou total.
Detalles experimentais
Células usadas para a secuenciación Case calquera mostra biolóxica dun organismo contén unha copia completa de ADN (incluso unha pequena cantidade de ADN ou de ADN antigo) e pode proporcionar o material xenético necesario para facer unha secuenciación xenómica completa. Ditas mostras poden ser de saliva, células epiteliais, medula ósea, pelo (con tal de que o pelo conteña a raíz do pelo), sementes, follas de plantas ou calquera outro elemento que teña células que conteñen ADN.
A secuencia xenómica dunha soa célula seleccionada dunha poboación mixta de células pode ser determinada usando técnicas de secuenciación xenónica dunha soa célula. Isto ten importantes vantaxes en microbioloxía ambiental en casos nos que unha soa célula dunha determinada especie de microorganismo pode illarse a partir dunha poboación mixta por microscopía baseándose na súa morfoloxía ou outras características distintivas. En tales casos os pasos necesarios normalmente de illamento e crecemento do organismo en cultivo poden omitirse, o que permite a secuenciación dun espectro moito maior de xenomas de organismos.
A secuenciación xenómica dunha soa célula está sendo probada como método de diagnose xenética preimplantación, na cal se toma unha célula do embrión creada por fecundación in vitro e analízase antes de facer a transferencia de embrións ao útero. Despois da implantación, pode extraerse o ADN fetal libre de células por medio dunha simple punción na vea da nai e usala para a secuenciación do xenoma completo do feto.
Primeiras técnicas
miniatura|Un analizador xenético ABI PRISM 3100. Estes secuenciadores capilares automatizaron as primeiras tarefas da secuenciación de xenomas. A secuenciación do xenoma humano case enteiro conseguiuse en 2000 parcialmene por medio do uso da tecnoloxía da secuenciación de escopeta. Aínda que a secuenciación de escopeta de xenoma total para pequenos xenomas (de 4.000–7.000 pares de bases) xa se utilizaba en 1979, a aplicación a maior escala beneficiouse da secuenciación de extremos emparellados, coñecida coloquialmente como secuenciación de escopeta de dobre canón. A medida que os proxectos de secuenciación empezaron a aplicarse a xenomas máis longos e complicados, moitos grupos de investigadores empezaron a decatarse de que a información útil podía obterse secuenciando ambos os extremos dun fragmento de ADN. Aínda que secuenciar ambos os extremos do mesmo fragmento e facer o seguimento dos datos emparellados era máis laborioso que secuenciar un só extremo de dous fragmentos distintos, saber que as dúas secuencias están orientadas en direccións opostas e están separadas aproximadamente a lonxitude dun fragmento era valioso para a reconstrución da secuencia do fragmento diana orixinal.
A primeira descrición publicada do uso de extremos por emparellados fíxose en 1990 como parte da secuenciación do locus do encima humano HPRT, aínda que o uso de extemos emparellados estaba limitado a pechar os ocos que quedaban despois de aplicar a estratexia tradicional da secuenciación de escopeta. A primeira descrición teórica da estratexia de secuenciación de extremos emparellados pura, asumindo fragmentos de lonxitude constante, fíxose en 1991. En 1995 introduciuse a innovación de usar fragmentos de variados tamaños, e demostrou que unha estratexia de secuenciación de extremos emparellados pura sería posible para dianas grandes. A estratexia foi despois adoptada por The Institute for Genomic Research (TIGR) para secuenciar o xenoma enteiro da bacteria Haemophilus influenzae en 1995, e despois por Celera Genomics para secuenciar o xenoma completo da mosca do vinagre en 2000, e posteriormente o xenoma humano completo. Applied Biosystems, agora chamada Life Technologies, fabricou os secuenciadores capilares automatizados utilizados por Celera Genomics e o Proxecto Xenoma Humano.
Técnicas actuais
Aínda que a secuenciación capilar foi a primeira aproximación para secuenciar con éxito o xenoma humano case completo é aínda demasiado cara, a súa aplicación consome moito tempo como para usala con propósitos comerciais. Desde 2005 a secuenciación capilar foi progresivamente desprazada polas tecnoloxías de secuenciación de alto rendemento (antes "da seguinte xeración") tales como a secuenciación de tinguidura de Illumina, a pirosecuenciación e secuenciación SMRT. Todas estas tecnoloxías continúan empregando a estratexia de escopeta básica, concretamente a paralelización e xeración de moldes por medio da fragmentación do xenoma.
Outras tecnoloxías emerxentes son a tecnoloxía de nanoporos. Aínda que a tecnoloxía de secuenciación de nanoporos está aínda sendo refinada, a súa portabilidade e capacidade potencial de xerar lecturas longas son de relevancia para aplicacións de secuenciación do xenoma completo.
Análise En principio, a secuenciación de xenoma completo pode proporcionar a secuencia de nucleótidos do ADN dun organismo. Porén, deben realizarse ulteriores análises para descubrir o significado biolóxico ou médico desta secuencia, e como este coñecemento se pode usar para axudar a previr enfermidades. Estanse a desenvolver e refinar métodos para analizar secuencias.
Como a secuenciación xera moitos datos (por exemplo, hai aproximadamente seis mil millóns de pares de bases en cada xenoma humano diploide), os datos que produce son almacenados electronicamente e require unha gran cantidade de poder de computación e capacidade de almacenamento.
Aínda que a análise de datos de secunciación do xenoma completo pode ser lento, é posible acelerar este paso usando hardware específico.
Comercialización miniatura|280px|Custo total da secuenciación do xenoma humano completo calculado polo NHGRI. Varias compañías públicas e privadas están competindo para desenvolver unha plataforma para a secuenciación do xenoma completo que sexa comercialmente robusta tanto para a investigación coma para o uso clínico, entre elas Illumina, Knome, Sequenom, 454 Life Sciences, Pacific Biosciences, Complete Genomics,