A proteína de unión á maltosa (ou que se liga ou une á maltosa), abreviada como MBP (do inglés maltose-binding protein) é unha proteína que forma parte do sistema maltosa/maltodextrina da bacteria Escherichia coli, que é resonsable da captación e catabolismo eficiente das maltodextrinas. Trátase dun complexo sistema de transporte e regulación que implica moitas proteínas e complexos proteicos. A MBP ten unha masa molecular aproximada de 42,5 kDa.

Estrutura e pregamento

A MBP está codificada polo xene malE de Escherichia coli. O xene malE codifica un polipéptido precursor de 396 residuos de aminoácidos), que orixina a MBP madura de 370 residuos por clivaxe da extensión NH2-terminal (26 residuos). As formas precursora e madura da MBP non conteñen ningún residuo de cisteína].

A MBP é unha proteína monomérica. As estruturas cristalinas mostran que a MBP está dividida en dous dominios globulares que están conectados por tres segmentos polipeptídicos curtos. Os dous dominios están separados por unha fenda profunda que contén o sitio de unión da maltosa/maltodextrinas. A comparación das estruturas das formas unidas a ligando e non unidas da MBP mostran que a unión da maltosa induce un gran cambio conformacional que pecha a fenda por medio dun movemento dos dous dominios arredor da bisagra polipeptidica de unión.

Tanto a forma precursora coma a madura da MBP son funcionais para a unión da maltosa. A extensión NH2-terminal diminúe a taxa de pregamento da forma precursora da MBP en relación coa súa forma madura a aproximadamente a 5ª parte, pero non ten efecto sobre a taxa de despregamento. O despregamento en equilibrio da MBP pode ser modelado por un mecanismo con dous estados cunha estabilidade ∆G(H2O) igual a 9,45 kcal mol−1 a 25 °C, pH 7,6.

Localización e exportación

A MBP é exportada ao espazo periplásmico de E. coli. A extensión NH2-terminal da MBP, tamén chamada péptido sinal, ten dúas funcións: (1) fai máis lento o pregamento do polipéptido acabado de sintetizar, e (2) dirixe este polipéptido á membrana e ao translocón SecYEG. Unha vez pregado, o precursor xa non pode entrar na vía de translocación. A introdución dun residuo de aminoácido cargado ou un residuo de prolina dentro do núcleo hidrófobo do péptido sinal é dabondo para bloquear a exportación. A exportación defectuosa que presentan as MBP mutantes é consistente coa conformación alfa-helicoidal e as interaccións hidrofóbicas do péptido sinal nas súas interaccións coa proteína motora translocón SecA.

Control da expresión

O xene malE, que codifica a MBP, pertence ao regulón Mal de E. coli, que consta de dez xenes cuxos produtos están dedicados á captación eficiente e utilización da maltosa e maltodextrinas. Todos os xenes implicados no transporte da maltosa/maltodextrina, incluíndo o malE, están agrupados na rexión malB de E. coli e organizados en dous operóns diverxentes: malE-malF-malG e malK-lamB. Os sitios de comezo da transcrición nos promotores de malEp e malKp están separados por unha distancia de 271 pares de bases.

Os promotores de malEp e malKp son activados sinerxicamente pola proteína MalT, o activador do regulón Mal e pola proteína receptora do AMPc CRP. Esta activación é un proceso acoplado que implica, indo desde o malEp cara ao malKp: dous sitios de unión de MalT; tres sitios de unión a CRP e dous conxuntos solapantes de tres sitios de unión de MalT, separados por un tramo de tres pares de bases. A activación da transcrición require a unión de adenosín trifosfato (ATP) e maltotriosa ao MalT e a unión de AMP cíclico ao dímero de CRP. A forma non unida a ligando da MalT é monomérica, mentres que a forma unida a ligando, en presenza de ATP e maltotriosa, é oligomérica.

Uso como vector peptídico e proteico

A MBP utilízase para incrementar a solubilidade das proteínas recombinantes expresadas en E. coli. Nestes sistemas, a proteína de interese exprésase a miúdo como unha MBP-proteína de fusión, o que prevén a agregación da proteína de interese. O mecanismo polo cal a MBP incremente a solubilidade non se coñece ben. Ademais, a propia MBP pode utilizarse como etiqueta de afinidade para a purificación de proteínas recombinantes. A proteína de fusión únese a columnas de amilosa mentres que todas as demais proteínas flúen ao seu través. A MBP-proteína de fusión pode ser purificada eluíndo a columna con maltosa. Unha vez que a proteína de fusión se obtén en forma purificada, a proteína de interese (X) é a miúdo clivada da MBP cunha protease específica. A proteína X pode despois ser separada da MBP por cromatografía de afinidade.

Un primeiro estudo das relacións entre a estrutura e as funcións da MBP foi realizado por inserción aleatoria dun curto fragmento de ADN, que codifica un sitio de restrición de BamHI, no xene malE. Algunhas das insercións afectaban as funcións da MBP mentres que outras eran permisivas. Os sitios permisivos que eran internos á MBP, foron usados para inserir péptidos antixénicos e estimulaban a resposta inmune en ratos. As insercións 3'-OH terminais foron utilizadas para crear proteínas de fusión e desenvolven o uso da MBP como soporte de afinidade para a purificación de proteínas e péptidos alleos por cromatografía de afinidade en amilosa con ligazóns cruzadas e a elución con maltosa en condicións físico-químicas suaves. Desenvolvéronse varios vectores plásmidos para facilitar a expresión e purificación desas proteínas de fusión.

Cando a MBP recombinante inclúe un péptido sinal, a proteína de fusión pode ser exportada ao espazo periplásmico, o cal facilita a súa purificación, xa que o fluído periplásmico só contén un número limitado de proteínas e pode ser recuperado por shock osmótico ou por permeabilización da membrana externa con antibióticos, por exemplo a polimixina B sulfato. Esta exportación da proteína de fusión no espazo periplásmico permite a formación de pontes disulfuro na proteína pasaxeira, por exemplo, fragmentos de anticorpo. As proteínas alleas que son exportadas ou segregadas nos seus organismos nativos, poden xeralmente ser exportadas ao periplasma de E. coli por fusión coa MBP. Exemplos de proteínas citoplasmáticas que poderían ser exportadas por fusión coa MBP, inclúen a polimerase de Klenow monomérica e a proteína do xene V dimérica do fago M13. Cando a MBP recombinante inclúe un péptido sinal defectuoso ou carece del a proteína de fusión permanece dentro do citoplasma bacteriano desde onde pode ser recuperada rompendo as células.

As proteínas de fusión con MBP xeralmente melloran a súa solubilkidade e facilitan o seu propio pregamento para que as proteínas de fusión sexan as máis das veces bifuncionais. Ademais, tales fusións poden facilitar a cristalización de proteínas difíciles, por exemplo as proteínas de membranas.

Notas

Véxase tamén Outros artigos Etiqueta proteica Biosensor de glicosa fluorescente Glutatión S-transferase (GSF)

Ligazóns externas N-Terminal Fusion of Target Protein to Maltose-Binding Protein na Michigan Technological University

Generic protocol for the expression and purification of recombinant proteins in Escherichia coli using a combinatorial His6-maltose binding protein fusion tag

Categoría:Proteínas