L'espectroscòpia de ressonància magnètica nuclear de proteïnes (normalment abreujada RMN de proteïnes) és un camp de la biologia estructural en què l'espectroscòpia RMN s'utilitza per obtenir informació sobre l'estructura i la dinàmica de les proteïnes, i també dels àcids nucleics i els seus complexos. El camp va ser iniciat per Richard R. Ernst i Kurt Wüthrich a l'ETH, i per Ad Bax, Marius Clore, Angela Gronenborn als NIH, i Gerhard Wagner a la Universitat de Harvard, entre d'altres. La determinació de l'estructura mitjançant espectroscòpia de RMN sol constar de diverses fases, cadascuna de les quals utilitza un conjunt separat de tècniques altament especialitzades. Es prepara la mostra, es fan les mesures, s'apliquen els enfocaments interpretatius i es calcula i valida una estructura.
La RMN implica les propietats mecànico-quàntiques del nucli central ("nucli") de l'àtom. Aquestes propietats depenen de l'entorn molecular local, i la seva mesura proporciona un mapa de com els àtoms estan units químicament, la seva proximitat a l'espai i la rapidesa amb què es mouen els uns respecte als altres. Aquestes propietats són fonamentalment les mateixes que les que s'utilitzen en la ressonància magnètica (RM) més familiar, però les aplicacions moleculars utilitzen un enfocament una mica diferent, adequat per al canvi d'escala de mil·límetres (d'interès per als radiòlegs) a nanòmetres (els àtoms enllaçats solen estar separats per una fracció de nanòmetre), un factor d'un milió. Aquest canvi d'escala requereix una sensibilitat de detecció i una estabilitat molt més elevades per a mesures a llarg termini. A diferència de la ressonància magnètica, els estudis de biologia estructural no generen directament una imatge, sinó que es basen en càlculs informàtics complexos per generar models moleculars tridimensionals.
Actualment, la majoria de les mostres s'examinen en una solució en aigua, però s'estan desenvolupant mètodes per treballar també amb mostres sòlides. La recollida de dades es basa en col·locar la mostra dins d'un imant potent, enviar senyals de radiofreqüència a través de la mostra i mesurar l'absorció d'aquests senyals. Depenent de l'entorn dels àtoms dins de la proteïna, els nuclis dels àtoms individuals absorbiran diferents freqüències de senyals de ràdio. A més, els senyals d'absorció de diferents nuclis poden ser pertorbats pels nuclis adjacents. Aquesta informació es pot utilitzar per determinar la distància entre nuclis. Aquestes distàncies, al seu torn, es poden utilitzar per determinar l'estructura general de la proteïna.
Un estudi típic podria incloure com dues proteïnes interactuen entre si, possiblement amb la finalitat de desenvolupar petites molècules que es puguin utilitzar per investigar la biologia normal de la interacció ("biologia química") o per proporcionar possibles pistes per a l'ús farmacèutic (desenvolupament de fàrmacs). Sovint, el parell de proteïnes que interactuen pot haver estat identificat mitjançant estudis de genètica humana, cosa que indica que la interacció es pot veure interrompuda per mutacions desfavorables, o poden tenir un paper clau en la biologia normal d'un organisme "model" com la mosca de la fruita, el llevat, el cuc C. elegans o els ratolins. Per preparar una mostra, normalment s'utilitzen mètodes de biologia molecular per obtenir quantitats de proteïna mitjançant l'expressió recombinant i la purificació a partir de bacteris. Això també permet canviar la composició isotòpica de la molècula, cosa desitjable perquè els isòtops es comporten de manera diferent i proporcionen mètodes per identificar senyals de RMN superposats.
Preparació de mostres miniatura|La mostra de RMN es prepara en un tub de vidre de paret fina. La ressonància magnètica nuclear de proteïnes es realitza en mostres aquoses de proteïnes altament purificades. Normalment, la mostra consta d'entre 300 i 600 microlitres amb una concentració de proteïnes d'entre 0,1 i 3 mil·limolars. La font de la proteïna pot ser natural o produïda en un sistema de producció utilitzant tècniques d'ADN recombinant mitjançant enginyeria genètica. Les proteïnes expressades recombinantment solen ser més fàcils de produir en quantitat suficient, i aquest mètode fa possible el marcatge isotòpic.
La proteïna purificada normalment es dissol en una solució tampó i s'ajusta a les condicions de dissolvent desitjades. La mostra de RMN es prepara en un tub de vidre de paret fina.
Recollida de dades La RMN de proteïnes utilitza experiments de ressonància magnètica nuclear multidimensional per obtenir informació sobre la proteïna. Idealment, cada nucli diferent de la molècula experimenta un entorn electrònic diferent i, per tant, té un desplaçament químic diferent pel qual pot ser reconegut. Tanmateix, en molècules grans com les proteïnes, el nombre de ressonàncies pot ser típicament de diversos milers i un espectre unidimensional inevitablement té solapaments incidentals. Per tant, es realitzen experiments multidimensionals que correlacionen les freqüències de diferents nuclis. Les dimensions addicionals disminueixen la possibilitat de solapament i tenen un contingut d'informació més gran, ja que correlacionen els senyals dels nuclis dins d'una part específica de la molècula. La magnetització es transfereix a la mostra mitjançant polsos d'energia electromagnètica (radiofreqüència) i entre nuclis mitjançant retards; el procés es descriu amb les anomenades seqüències de polsos. Les seqüències de polsos permeten a l'experimentador investigar i seleccionar tipus específics de connexions entre nuclis. La gamma d'experiments de ressonància magnètica nuclear utilitzats en proteïnes es divideix en dues categories principals: una on la magnetització es transfereix a través dels enllaços químics i una altra on la transferència es produeix a través de l'espai, independentment de l'estructura d'enllaç. La primera categoria s'utilitza per assignar els diferents desplaçaments químics a un nucli específic, i la segona s'utilitza principalment per generar les restriccions de distància utilitzades en el càlcul de l'estructura i en l'assignació amb proteïna no marcada.
Depenent de la concentració de la mostra, el camp magnètic de l'espectròmetre i el tipus d'experiment, un únic experiment de ressonància magnètica nuclear multidimensional en una mostra de proteïna pot trigar hores o fins i tot diversos dies per obtenir una relació senyal-soroll adequada mitjançant la mitjana del senyal i per permetre una evolució suficient de la transferència de magnetització a través de les diverses dimensions de l'experiment. En igualtat de condicions, els experiments de dimensions superiors trigaran més que els experiments de dimensions inferiors.
Normalment, el primer experiment que es mesura amb una proteïna marcada amb isòtops és un espectre de correlació quàntica única heteronuclear (HSQC) 2D, on "heteronuclear" es refereix a nuclis diferents de 1H. En teoria, la correlació quàntica heteronuclear única té un pic per a cada H unit a un heteronucli. Així, en el 15N-HSQC, amb una proteïna marcada amb 15N, s'espera un senyal per a cada àtom de nitrogen de l'os vertebral, amb l'excepció de la prolina, que no té hidrogen amida a causa de la naturalesa cíclica del seu esquelet. Cada residu amb un enllaç nitrogen-hidrogen a la seva cadena lateral (W, N, Q, R, H, K) aporta senyals 15N-HSQC addicionals. El 15N-HSQC sovint es coneix com l'empremta digital d'una proteïna perquè cada proteïna té un patró únic de posicions de senyal. L'anàlisi del 15N-HSQC permet als investigadors avaluar si hi ha el nombre esperat de pics i, per tant, identificar possibles problemes deguts a múltiples conformacions o heterogeneïtat de la mostra. L'experiment de correlació quàntica única heteronuclear, relativament ràpid, ajuda a determinar la viabilitat de fer experiments posteriors més llargs, més cars i més elaborats. No és possible assignar pics a àtoms específics només a partir de la correlació quàntica heteronuclear única.
Assignació de ressonància Per tal d'analitzar les dades de ressonància magnètica nuclear, és important obtenir una assignació de ressonància per a la proteïna, és a dir, esbrinar quin desplaçament químic correspon a quin àtom. Això s'aconsegueix normalment mitjançant un recorregut seqüencial utilitzant informació derivada de diversos tipus diferents d'experiments de RMN. El procediment exacte depèn de si la proteïna està marcada isotòpicament o no, ja que molts dels experiments d'assignació depenen del carboni-13 i el nitrogen-15. miniatura|370x370px|Comparació d'espectres 2D COSY i TOCSY per a un aminoàcid com el glutamat o la metionina. El TOCSY mostra pics creuats diagonals entre tots els protons de l'espectre, però el COSY només té pics creuats entre veïns.
Ressonància magnètica nuclear homonuclear Amb proteïnes no marcades, el procediment habitual és registrar un conjunt d'experiments de ressonància magnètica nuclear homonuclear bidimensionals mitjançant espectroscòpia de correlació (COSY), dels quals diversos tipus inclouen espectroscòpia de correlació convencional, espectroscòpia de correlació total (TOCSY) i espectroscòpia d'efecte nuclear Overhauser (NOESY). Un experiment de ressonància magnètica nuclear bidimensional produeix un espectre bidimensional. Les unitats d'ambdós eixos són desplaçaments químics. La magnetització de COSY i TOCSY es transfereix a través dels enllaços químics entre protons adjacents. L'experiment d'espectroscòpia de correlació convencional només és capaç de transferir la magnetització entre protons en àtoms adjacents, mentre que en l'experiment d'espectroscòpia de correlació total els protons són capaços de transmetre la magnetització, de manera que es transfereix entre tots els protons que estan connectats per àtoms adjacents. Així, en una espectroscòpia de correlació convencional, un protó alfa transfereix magnetització als protons beta, els protons beta es transfereixen als protons alfa i gamma, si n'hi ha, i després el protó gamma es transfereix als protons beta i delta, i el procés continua. En l'espectroscòpia de correlació total, els protons alfa i tots els altres són capaços de transferir magnetització als protons beta, gamma, delta i epsilon si estan connectats per una cadena contínua de protons. La cadena contínua de protons és la cadena lateral dels aminoàcids individuals. Així, aquests dos experiments s'utilitzen per construir els anomenats sistemes d'espín, és a dir, construir una llista de ressonàncies del desplaçament químic del protó del pèptid, els protons alfa i tots els protons de la cadena lateral de cada residu. Quins desplaçaments químics corresponen a quins nuclis del sistema d'espín es determinen mitjançant les connectivitats convencionals de l'espectroscòpia de correlació i el fet que diferents tipus de protons tenen desplaçaments químics característics. Per connectar els diferents sistemes d'espín en un ordre seqüencial, s'ha d'utilitzar l'experiment d'espectroscòpia d'efecte nuclear Overhauser. Com que aquest experiment transfereix la magnetització a través de l'espai, mostrarà pics creuats per a tots els protons que són propers a l'espai, independentment de si es troben en el mateix sistema d'espín o no. Els residus veïns són inherentment propers a l'espai, de manera que les assignacions es poden fer mitjançant els pics del NOESY amb altres sistemes d'espín.
Un problema important que utilitza la ressonància magnètica nuclear homonuclear és la superposició entre pics. Això passa quan diferents protons tenen els mateixos o molt similars desplaçaments químics. Aquest problema augmenta a mesura que la proteïna es fa més gran, de manera que la ressonància magnètica nuclear homonuclear normalment es limita a proteïnes o pèptids petits.
Ressonància magnètica nuclear de nitrogen-15