miniatura|Un aparell de replegament automàtic per a la producció de proteïnes a escala preparativa. L'enginyeria de proteïnes és el procés de desenvolupar proteïnes útils o valuoses mitjançant el disseny i la producció de polipèptids no naturals, sovint alterant les seqüències d'aminoàcids que es troben a la natura. És una disciplina jove, amb molta recerca en la comprensió del plegament de proteïnes i el reconeixement dels principis de disseny de proteïnes. S'ha utilitzat per millorar la funció de molts enzims per a la catàlisi industrial. També és un mercat de productes i serveis, amb un valor estimat de 168.000 milions de dòlars el 2017.
Hi ha dues estratègies generals per a l'enginyeria de proteïnes: el disseny racional de proteïnes i l'evolució dirigida. Aquests mètodes no són mútuament excloents; els investigadors sovint aplicaran tots dos. En el futur, un coneixement més detallat de l'estructura i la funció de les proteïnes, i els avenços en el cribratge d'alt rendiment, poden ampliar considerablement les capacitats de l'enginyeria de proteïnes. Finalment, fins i tot es podrien incloure aminoàcids no naturals, mitjançant mètodes més nous, com ara el codi genètic expandit, que permeten codificar nous aminoàcids en el codi genètic. Les aplicacions en nombrosos camps, inclosa la medicina i el bioprocessament industrial, són àmplies i nombroses. miniatura|Visualització en temps real de la simulació de membrana a PyMOL. Visualització d'una simulació d'acoblament simètric del canal de potassi del complex proteic KcsA (PDB ID 1bl8). Per a cada canvi conformacional a la simulació, Rosetta envia una estructura actualitzada a PyMOL a través del PyMOL Mover. La nova estructura es mostra en temps real a PyMOL. Subunitats asimètriques acolorides independentment. El complex s'assembla primer a partir d'una sola subunitat asimètrica, s'acobla en baixa resolució i després es refina en alta resolució.
Enfocaments Disseny racional En el disseny racional de proteïnes, un científic utilitza un coneixement detallat de l'estructura i la funció d'una proteïna per fer els canvis desitjats. En general, això té l'avantatge de ser econòmic i tècnicament fàcil, ja que els mètodes de mutagènesi dirigida estan ben desenvolupats. Tanmateix, el seu principal inconvenient és que el coneixement estructural detallat d'una proteïna sovint no està disponible i, fins i tot quan està disponible, pot ser molt difícil predir els efectes de diverses mutacions, ja que la informació estructural sovint proporciona una imatge estàtica de l'estructura d'una proteïna. Tanmateix, programes com Folding@home i Foldit han utilitzat tècniques proveïment participatiu ( crowdsourcing) per obtenir informació sobre els motius de plegament de les proteïnes.
Els algorismes de disseny computacional de proteïnes busquen identificar noves seqüències d'aminoàcids que tinguin un baix contingut d'energia quan es pleguen a l'estructura objectiu preespecificada. Tot i que l'espai de conformació de seqüència que cal cercar és gran, el requisit més difícil per al disseny computacional de proteïnes és una funció energètica ràpida, però precisa, que pugui distingir les seqüències òptimes de les subòptimes similars.
Alineació de seqüències múltiples miniatura|Cicle de visualització en fags. 1) les proteïnes de fusió per a una proteïna de recobriment viral + el gen que s'ha d'evolucionar (normalment un fragment d'anticòs) s'expressen en el bacteriòfag. 2) la biblioteca de fags es renta sobre una diana immobilitzada. 3) els aglutinants d'alta afinitat restants s'utilitzen per infectar bacteris. 4) els gens que codifiquen els aglutinants d'alta afinitat s'aïllen. 5) aquests gens poden tenir mutacions aleatòries introduïdes i utilitzades per realitzar una altra ronda d'evolució. Els passos de selecció i amplificació es poden realitzar diverses vegades amb més rigor per aïllar aglutinants d'alta afinitat. Sense informació estructural sobre una proteïna, l'anàlisi de seqüències sovint és útil per elucidar informació sobre la proteïna. Aquestes tècniques impliquen l'alineació de les seqüències de proteïnes diana amb altres seqüències de proteïnes relacionades. Aquest alineament pot mostrar quins aminoàcids es conserven entre espècies i són importants per a la funció de la proteïna. Aquestes anàlisis poden ajudar a identificar aminoàcids de punts calents que poden servir com a llocs diana per a mutacions. L'alineació de seqüències múltiples utilitza bases de dades com ara PREFAB, SABMARK, OXBENCH, IRMBASE i BALIBASE per tal de creuar les seqüències de proteïnes diana amb seqüències conegudes. A continuació es llisten les tècniques d'alineació de seqüències múltiples.
Anàlisi coevolutiva L'anàlisi coevolutiva també es coneix com a mutació correlacionada, covariació o cosubstitució. Aquest tipus de disseny racional implica canvis evolutius recíprocs en loci que interactuen evolutivament. Generalment, aquest mètode comença amb la generació d'alineacions de seqüències múltiples curades per a la seqüència objectiu. Aquesta alineació se sotmet a un refinament manual que implica l'eliminació de seqüències amb buits elevats, així com de seqüències amb baixa identitat de seqüència. Aquest pas augmenta la qualitat de l'alineació. A continuació, l'alineació processada manualment s'utilitza per a mesures coevolutives posteriors mitjançant algoritmes de mutació correlacionada diferents. Aquests algoritmes donen com a resultat una matriu de puntuació de coevolució. Aquesta matriu es filtra aplicant diverses proves de significació per extreure valors de coevolució significatius i eliminar el soroll de fons. Les mesures coevolutives s'avaluen més a fons per avaluar el seu rendiment i rigor. Finalment, els resultats d'aquesta anàlisi coevolutiva es validen experimentalment.
Predicció estructural La generació de novo de proteïnes es beneficia del coneixement de les estructures de proteïnes existents. Aquest coneixement de l'estructura de proteïnes existent ajuda a la predicció de noves estructures de proteïnes. Els mètodes per a la predicció de l'estructura de proteïnes es divideixen en una de les quatre classes següents: ab initio, mètodes basats en fragments, modelització d'homologia i enfilat de proteïnes.
Enllaç multivalent La unió multivalent es pot utilitzar per augmentar l'especificitat i l'afinitat d'unió a través d'efectes d'aviditat. Tenir múltiples dominis d'unió en una sola biomolècula o complex augmenta la probabilitat que es produeixin altres interaccions a través d'esdeveniments d'unió individuals. L'aviditat o l'afinitat efectiva pot ser molt més alta que la suma de les afinitats individuals, proporcionant una eina rendible i eficaç en termes de temps per a la unió dirigida.
Evolució dirigida En l'evolució dirigida, la mutagènesi aleatòria, per exemple, mitjançant PCR propensa a errors o mutagènesi per saturació de seqüències, s'aplica a una proteïna i s'utilitza un règim de selecció per seleccionar variants que tinguin els trets desitjats. A continuació, s'apliquen rondes addicionals de mutació i selecció. Aquest mètode imita l'evolució natural i, en general, produeix resultats superiors al disseny racional. Un procés afegit, anomenat barreja d'ADN, barreja i combina peces de variants reeixides per produir millors resultats. Aquests processos imiten la recombinació que es produeix naturalment durant la reproducció sexual. Els avantatges de l'evolució dirigida són que no requereix coneixements estructurals previs d'una proteïna, ni cal poder predir quin efecte tindrà una mutació determinada. De fet, els resultats dels experiments d'evolució dirigida sovint són sorprenents, ja que els canvis desitjats sovint són causats per mutacions que no s'esperava que tinguessin cap efecte. L'inconvenient és que requereixen un cribratge d'alt rendiment, que no és factible per a totes les proteïnes. Cal mutar grans quantitats d'ADN recombinant i analitzar els productes per detectar els trets desitjats. El gran nombre de variants sovint requereix equips robòtics cars per automatitzar el procés. A més, no totes les activitats desitjades es poden detectar fàcilment.
Mètodes asexuals Els mètodes asexuals no generen cap enllaç creuat entre els gens parentals. Es fan servir gens individuals per crear biblioteques mutants mitjançant diverses tècniques mutagèniques. Aquests mètodes asexuals poden produir mutagènesi aleatòria o focalitzada.
Mètodes sexuals Els mètodes sexuals d'evolució dirigida impliquen la recombinació in vitro, que imita la recombinació natural in vivo. Generalment, aquestes tècniques requereixen una alta homologia de seqüència entre les seqüències parentals. Aquestes tècniques s'utilitzen sovint per recombinar dos gens parentals diferents, i aquests mètodes creen encreuaments entre aquests gens.
Barrejant exons La barreja d'exons és la combinació d'exons de diferents proteïnes mitjançant esdeveniments de recombinació que es produeixen als introns. La barreja d'exons ortòlegs implica la combinació d'exons de gens ortòlegs de diferents espècies. La barreja de dominis ortòlegs implica la barreja de dominis proteics sencers de gens ortòlegs de diferents espècies. La barreja d'exons paràlegs implica la barreja d'exons de diferents gens de la mateixa espècie. La barreja de dominis paràlegs implica la barreja de dominis proteics sencers de proteïnes paràlogues de la mateixa espècie. La barreja d'homòlegs funcionals implica la barreja de dominis no homòlegs que estan relacionats funcionalment. Tots aquests processos es duen a terme amb l'amplificació dels exons desitjats de diferents gens mitjançant oligonucleòtids sintètics quimèrics. Aquests productes d'amplificació es tornen a muntar en gens de longitud completa mitjançant PCR sense encebadors. Durant aquests cicles de PCR, els fragments actuen com a plantilles i encebadors. Això dóna lloc a gens quimèrics de longitud completa, que després se sotmeten a cribratge.
Disseny semiracional El disseny semiracional utilitza informació sobre la seqüència, l'estructura i la funció d'una proteïna, juntament amb algoritmes predictius. Junts, aquests s'utilitzen per identificar els residus d'aminoàcids diana que tenen més probabilitats d'influir en la funció de les proteïnes. Les mutacions d'aquests residus d'aminoàcids clau creen biblioteques de proteïnes mutants que tenen més probabilitats de tenir propietats millorades.
Els avenços en l'enginyeria enzimàtica semiracional i el disseny enzimàtic de novo ofereixen als investigadors marcs eficients per a la manipulació de biocatalitzadors. La integració d'enfocaments basats en seqüències i estructures en el redisseny d'enzims ha demostrat reduir significativament les iteracions de variants, eliminant la necessitat d'anàlisi d'alt rendiment. Tanmateix, els mètodes computacionals de novo i de redisseny actuals són inferiors a les variants evolucionades en el rendiment catalític. Per tancar aquesta bretxa, s'espera que els refinaments dels algoritmes de disseny, com ara la integració de la dinàmica de les proteïnes en futures simulacions, millorin encara més la precisió en les prediccions d'estructura i millorin la capacitat catalítica.
Tècniques de cribratge i selecció