La tècnica de la MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) és una tècnica similar a la PCR múltiple que, fent servir un únic parell d'encebadors, permet dur a terme l'amplificació de múltiples seqüències diana d'ADN. Es tracta d'un mètode ràpid, fiable, efectiu i de baix cost, amb aplicacions a diferents àmbits, com ara la genètica o la medicina. La baixa quantitat d'ADN necessària per dur a terme la MLPA (20ng d'ADN humà, l'equivalent a 3.000 cèl·lules) fa que es pugui dur a terme en un considerable nombre d'ocasions. miniatura|Procés MLPA
Orígens La tècnica de la MLPA va ser desenvolupada per MRC-Holland (Microbiology Research Center Holland), una empresa holandesa fundada l'any 1985 pel Dr. Jan Schouten i la qual en té la patent. Al seu inici, la MRC-Holland fabricava una varietat de productes relacionats amb la biotecnologia, com ara enzims de restricció, enzims modificadors de l'ADN o marcadors de l'ADN. Ara per ara, l'empresa està totalment centrada en activitats relacionades amb la MLPA, cosa que li ha permès oferir una sèrie de variants de la tècnica en funció de l'objectiu per al qual s'usa.About MRC-Holland , MRC-Holland.org. Consultat el 20 d'octubre de 2013.
Aquesta tècnica va ésser introduïda per primer cop el gener de l'any 2002 per Shouten JP et al., a la revista Nucleic Acid Research. Des de llavors, s'ha estès amb rapidesa i ha anat guanyant acceptació i importància dins l'àmbit de la recerca i ladiagnosi: es fa servir amb freqüència en més de 800 laboratoris de 80 països i, cada any, es duen a terme més d'un milió de reaccions de MLPA.MRC-Holland (2011). Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA): copy number quantification & metilation detectation. Consultat el 14 de maig de 2012.
Tot i que alguns laboratoris obtenen les sondes (probes) per dur a terme la reacció de la MLPA de l'empresa on té origen, també n'hi ha d'altres que dissenyen les seves pròpies a partir del protocol proporcionat per MCR-HollandMRC-Holland (2012). Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA): instructions for use. Consultat el 15 d'octubre de 2013. de tal manera que, partint de l'original, hi introdueixen petites variacions que permetin fer-la més específica per a l'objectiu buscat.Zhi J. <<MAPD: a probe design suite for multiplex ligationdependent probe amplification assays>>. BMC Research Notes, 137, 3, 2010. DOI: 10.1186/1756-0500-3-137.
Característiques i fonaments La tècnica de la multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) és una tècnica amb unes bases molt similars a les de la reacció en cadena de la polimerasa (PCR), ja que, en certa manera, podria considerar-se una variació de la PCR múltiple. La MLPA permet quantificar, simultàniament i de manera relativa, el nombre de còpies de fins a 45-50 loci de l'ADN, cosa que facilita la detecció d'un nombre anòmal de còpies i, per tant, la presència de mutacions en el genoma.Jeuken J.; Cornelissen S.; Boots-Sprenger S.; Gijsen S.; Wesseling P. <<Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification: A Diagnostic Tool for Simultaneous Identification of Different Genetic Markers in Glial Tumors>>. J Mol Diagn, 8, 4, 2006, pàg. 433-443. DOI: 10.2353/jmoldx.2006.060012 Això obre l'opció de fer servir aquesta tècnica per analitzar ADN molt fragmentat i, a més, permet trobar mutacions a nivell d'un únic exó.Hömig-Hözel C.; Savola S. <<Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) in Tumor Diagnostics and Prognostics>>. Diag Mol Pathol, 21, 4, 2012, pàg. 189-206.
Per dur a terme aquesta amplificació fem servir una sonda (probe) formada per dos encebadors o primers (oligonucleòtids) que s'uneixen a llocs específics (seqüències diana o targets) i adjacents de la mostra d'ADN analitzada. Aquests encebadors són específics pel caràcter que estem estudiant, i la hibridació només tindrà lloc en cas que en els nucleòtids que el codifiquen no hi hagi cap anomalia.Schouten JP.; McElgunn CJ.; Waaijer R.; Zwijnenburg D.; Diepvens F.; Pals G. <<Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification>>. Nucleic Acids Res, 30, 12 e57, 2002. DOI:10.1093/nar/gnf056. PMC: 117299. Per tant, en dissenyar la sonda que es farà servir en la MLPA, es pot assolir una alta precisió, creant sondes per a mutacions específiques de gran utilitat en, per exemple, el diagnòstic clínic. A més, la quantitat d'ADN accessori és mínima, cosa que no es dona en la PCR, ja que en aquesta s'amplifica tota la cadena que conté la seqüència diana.
Un cop els encebadors estiguin units a la mostra d'ADN, intervé una ligasa (en particular, la ligasa-65Murugan S.; Chandramohan A.; Lakshmi BR. <<Use of múltiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) for Duchenne muscular dystrophy (DMD) gene mutation analysis>>. Indian J Med Res, 2010, pàg. 303-311.) que crea una unió entre ells, formant un sol fragment d'una longitud determinada. Aquests són els nucleòtids que seran amplificats, i els quals, després de dur a terme una electroforesi capil·lar amb els productes de l'amplificació, es veuran reflectits en els resultats.Wooderchak-Donahue W.; Vaughn C.; Chou L.; Lewis T. et al. <<Verification of Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification Probes in the Abscence of Positive Samples>>. Genet Test Mol Bioma, 15, 11, 2011, pàg. 793-799. DOI: 10.1089/gtmb.2011.0051 Aquest és un tret molt característic de la MLPA, que també es podria considerar la principal diferència amb la PCR múltiple, ja que en la primera no s'amplifica l'ADN en si, sinó només la sonda que hem dissenyat i que ens permet dur-la a terme.
Per tant, hem de tenir en compte que es tracta d'una prova relativa, ja que el que ens mostren els resultats és el contrast entre la presència d'uns particulars exons en la mostra a analitzar i en la mostra control.Willis A.; van den Veyver I.; Eng C. <<Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) and prenatal diagnosis>>. Prenat Diagn, 32, 2012, pàg. 315-320. DOI: 10.1002/pd.3860 Així, l'absència de pics (que reflecteixen els fragments en els quals la ligasa ha pogut intervenir i, per tant, els que s'han amplificat) indicaria mutacions en els gens en qüestió, ja que anomalies en els seus nucleòtids haurien impedit que la hibridació i, en conseqüència, l'actuació de la ligasa.
Procediment Obtenció i tractament de les mostres La tècnica del MLPA requereix, a part de l'anàlisi de la mostra d'ADN que ens interessa estudiar, l'anàlisi d'una segona mostra de referència (grup de control), obtinguda d'un individu sa. Això és degut al caràcter relatiu dels resultats que s'obtenen, els quals per si sols no ens proporcionen cap informació útil i només els podem interpretar per comparació. Es recomana que ambdues mostres s'hagin extret i purificat mitjançant el mateix mètode i que provinguin del mateix tipus de teixit, reduint així les diferències no biològiques i les variacions estructurals. A més, convé que tinguin una concentració similar.
Per evitar alterar les mostres i reduir la presència de contaminants com ara sals, és preferible no dur a terme l'extracció per mètodes Qiagen, EZ1, M6, M48 o M96. S'ha de tenir en compte que el MLPA és molt més sensible als contaminants que les proves de PCR simples, a causa de la seva especificitat. Si hi ha dubtes sobre la presència de contaminants en la mostra, s'ha de purificar amb silica.
En cas de comptar amb ADN en molt bon estat, la quantitat òptima a utilitzar és d'entre 50ng i 100ng. En cas contrari, s'obtindran resultats més fiables per a quantitats inferiors, d'entre 20ng i 50ng. Tot i així, es pot treballar amb quantitats de fins a 500ng.Park D. <<PCR Protocols>>. Springer Science, 2011, pàg. 193-206. DOI: 10.1007/978-1-60761-944-4
Les mostres s'han de diluir en TE0.1 (preparació composta per 10 mM de Tris-HCl pH 8.2 i 0.1 mM d'EDTA) fins a un volum de 5μl.* Aquesta solució protegeix l'ADN de la despurinització (trencaments dels enllaços glicosídics entre les desoxiriboses i les bases nucleiques púriques, guanines i adenines, amb la consegüent pèrdua d'aquestes) que succeiria, en el cas d'haver diluït en aigua, durant la posterior desnaturalització.
Desnaturalització de l'ADN La primera fase del procés és la desnaturalització o separació de la doble hèlix de l'ADN. Per a realitzar-la, se sotmeten les mostres a una temperatura de 98 °C durant 5min amb l'ajut d'un termociclador. Després es redueix la temperatura a 25 °C.
Hibridació A continuació s'afegeixen, a cada mostra, 3μl de dissolució que conté les sondes específiques per a cada seqüència de nucleòtids a estudiar. Cada sonda està formada per dos oligonucleòtids separats, els quals contenen els encebadors universals per a la posterior amplificació per PCR, la seqüència de nucleòtids complementària a la del gen diana, i una tercera secció la mida de la qual és diferent per a cada sonda i que permetrà identificar-les un cop separades per electroforesi. Aplicant primer una temperatura de 95 °C durant 1min i a continuació deixant-les reposar a 60 °C durant 16-20h, els dos oligonucleòtids de cada sonda s'hibridaran a seqüències adjacents dels gens a analitzar.
Lligadura Seguidament té lloc la unió dels parells d'oligonucleòtids de cada sonda per l'acció d'enzims ligasa-65. A cada mostra s'afegeixen els compostos que proporcionaran, a part dels enzims necessaris, un medi favorable per a la reacció (25μl d'H2O, 3μl de Ligase Buffer A, 3μl de Ligase Buffer B i 1μl de Ligase-65 enzyme en el cas d'utilitzar productes de MRC-Holland). A continuació s'incuben les mostres a 54 °C durant almenys 15min, moment en què els enzims es troben a una temperatura òptima per treballar i es produeix la lligació. Després s'augmenta la temperatura fins a 98 °C durant 5min, inactivant les ligases-65, i es refreda fins als 20 °C per retirar les mostres del termociclador.
Aquesta unió només és possible si els dos fragments de la sonda s'han hibridat correctament a les seqüències diana, és a dir, si la seqüència de l'ADN a estudiar es correspon amb la complementària dels fragments sonda i, per tant, si no hi ha mutacions en aquests fragments del genoma.
Amplificació per PCR Es procedeix a l'amplificació per PCR dels parells d'oligonucleòtids correctament units. Aquests són els únics que contenen els dos encebadors necessaris per a la reacció i, per tant, són els únics que es replicaran, de manera que no és necessari eliminar els parells no units.
A cada mostra s'afegirà un preparat amb els substrats necessaris per a la reacció (compost per 7.5μl d'H2O, 2μl de SALSA PCR primer mix, 0.5μl de SALSA Polymerase i 10μl de polymerase mix en el cas de productes MRC-Holland) a temperatura ambient. A continuació s'iniciarà un programa de termociclació compost per 35 cicles de 30 segons a 95 °C (desnaturalització), 30 segons a 60 °C (aparellament) i 60 segons a 72 °C (extensió), mantenint al final de l'últim cicle la temperatura de 72 °C durant 20min.Jeuken J.; Cornelissen S.;Boots-Sprenger S.; Gijsen S.; Wesseling P. <<Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification, A Diagnostic Tool for Simultaneous Identification of Different Genetic Markers in Glial Tumors>>. Journal of Molecular Diagnostics, 8, 4, 2006. DOI: 10.2353/jmoldx.2006.060012
Electroforesi capil·lar Per acabar, es fa una electroforesi capil·lar de les mostres. Mitjançant aquesta se separen els diferents productes de l'amplificació, corresponents a cada una de les seqüències a estudiar, i s'analitza la quantitat relativa de cadascun comparant-la amb l'obtinguda en la mostra de referència. Com que cada sonda té una mida específica (i per tant un pes molecular concret), resulta senzill identificar a quina seqüència d'ADN correspon cada mesura. Diferències significatives en la intensitat del senyal entre la mostra a estudiar i la de referència indicaran delecions o multiplicacions de gens, que podran estar relacionades amb la presència de patologies.
Avantatges i limitacions