miniatura|Estructura Proteïna Fluorescent Verda La proteïna de fluorescència verda o GFP (de l'anglès green fluorescent protein) és una proteïna produïda per la medusa Aequorea victoria, que emet fluorescència (no confondre amb bioluminescència) quan s'exposa a la llum blava. Té una longitud d'ona màxima d'absorció de llum a 395 nm i un altre pic menys intens a 475 nm. El primer pic es troba a la regió inferior de l'espectre visible, corresponent al verd. Tot i relacionar generalment la GFP amb Aequorea victoria, hi ha altres organismes marins que tenen proteïnes fluorescents verdes similars.
En biologia cel·lular i molecular, el gen de la GFP s'utilitza amb freqüència com un gen indicador. En formes modificades s'ha utilitzat per fer biosensors, i molts animals s'han manipulat per expressar la GFP i provar que un gen es pot expressar a través d'un organisme donat. El gen de la GFP es pot introduir en els organismes i mantenir-se en el seu genoma a través de la reproducció, la injecció amb un vector viral o la transformació cel·lular. Fins ara, el gen de la GFP s'ha introduït i expressat en molts bacteris, llevats i altres fongs, peixos (com el peix zebra), plantes, mosques, i cèl·lules de mamífers, incloent humans. Martin Chalfie, Osamu Shimomura i Roger Y. Tsien van ser guardonats amb el Premi Nobel de Química el 10 d'octubre de 2008 pel descobriment i desenvolupament d'aquesta proteïna.
Història Osamu Shimomura és el primer protagonista d'aquesta sèrie de premiats. El 1955, tot i les dificultats que la Segona Guerra Mundial i la consegüent devastació del Japó varen ocasionar a la seva carrera com a biòleg marí, fou contractat com ajudant pel professor Yashimasa Hirata de la Universitat de Nagoya. Poc després, va rebre la tasca d'aïllar la substància responsable de la luminescència del mol·lusc Cypridina. Encara que era un projecte dificultós, Shimomura aconseguí aïllar la proteïna corresponent el 1956. Un cop publicats els seus resultats, l'investigador va ser admès pel professor Frank Johnson a la Universitat de Princeton (Nova Jersey). Fou durant la seva estada als Estats Units que Shimomura sentí a parlar per primera vegada de l'Aequorea victoria i de la seva fluorescència característica. Des dels Laboratoris Friday Harbor, dirigits per Robert Fernald, l'equip de Shimomura inicià la tasca de recol·lectar meduses pels seus nous estudis. Shimomura havia observat que l'activitat bioluminescent s'inactivava a pH àcid i s'activava de nou a pH neutre. No obstant això, fou per casualitat, que l'investigador va observar un centelleig lluminós blau. Aviat va comprendre que el responsable de l'activació era un component de l'aigua del mar i, posteriorment, deduí que era el Ca2+. El descubrimientO de las proteínas fluorescentes y su utilidad en la investigación biomédica(Premio Nobel de Química de 2008) A principis de la dècada de 1960 Osamu Shimomura, a més d'aconseguir aïllar la GFP de la medusa Aequorea Victoria, va identificar quina part era responsable de la fluorescència. La interacció de la proteïna aequorina luminescent, també aïllada en aquella època, amb els ions Ca2+ induïa el resplendor blau observat. A la dècada dels anys setanta s'arribà a la conclusió que part d'aquesta energia lluminosa es transfereix a la GFP, canviant el color del conjunt cap al verd. El fet que la GFP sigui una proteïna de mida reduïda i que no necessita cap cofactor perquè la fluorescència tingui lloc expliquen la seva gran utilitat.
El gran interès dels biòlegs per la GFP començà el 1992, quan Douglas Prasher va publicar la seqüència de nucleòtids de la wtGFP a la revista Gene. El finançament d'aquest projecte es va esgotar, de manera que Prasher envià mostres de cDNA a diversos laboratoris. El laboratori de Martin Chalfie va expressar la seqüència de codificació de la wtGFP amb els primers pocs aminoàcids eliminats en les cèl·lules dEscherichia coli i Caenorhabditis elegans, publicant els resultats a la revista Science el 1994. Independentment, el laboratori de Frederick Tsuji va informar de l'expressió de la proteïna recombinant un mes més tard. Cal destacar que la molècula de GFP es doblegava i era fluorescent a temperatura ambient, sense la necessitat de cofactors exògens específics. Malgrat això, aquest fet tenia diversos inconvenients, com la formació d'un espectre d'excitació de doble pic, la sensibilitat al pH, la sensibilitat al clorur, el rendiment quàntic de fluorescència pobre, la dèbil fotoestabilitat i el plegament deficient a 37 °C.
Finalment, Roger Y. Tsien establí el mecanisme molecular pel qual la GFP adquireix la seva fluorescència característica i en donà a conèixer la seva estructura tridimensional. L'equip de Tsien també destaca per la diversitat de colors que ha arribat a obtenir a partir de derivats de la GFP. El primer informe sobre l'estructura cristal·lina de la GFP va ser el de la S65T mutant, dut a terme pel grup de Remington i publicat a la revista Science el 1996. Un mes després el grup Phillips va informar de l'estructura de la wtGFP a la revista Nature Biotech. Aquestes estructures cristal·lines proporcionaren uns antecedents vitals en la formació de cromòfors i en les interaccions entre residus veïns. Els investigadors han modificat aquests residus mitjançant mutagènesis dirigides i aleatòries per produir la gran varietat de derivats de la GFP que estan en ús actualment.
Martin Chalfie, Osamu Shimomura i Roger Y. Tsien van compartir el Premi Nobel de Química 2008 pel descobriment i desenvolupament de tècniques usant la proteïna fluorescent verda.
Presència a la natura El propòsit tant de la bioluminescència com de la fluorescència de la GFP en les meduses es desconeix. La GFP és co-expressada amb l'aequorina en petits grànuls al voltant de la vora de l'ombrel·la de les meduses. El pic d'excitació secundària (480 nm) de la GFP absorbeix part de l'emissió blava de aequorina, donant a la bioluminescència una tonalitat més verda. El residu 65 de serina del cromòfor de la GFP és responsable dels espectres d'excitació de doble pic de la GFP de tipus salvatge i es conserva a les tres isoformes de la GFP originalment clonades per Prasher. Gairebé totes les mutacions d'aquest residu consoliden els espectres d'excitació d'un sol pic a 395nm o bé a 480nm. El mecanisme exacte d'aquesta sensibilitat és complex, però probablement implica la donació d'un hidrogen de la serina 65 al glutamat 222, que influeix en la ionització del cromòfor. Tot i que una sola mutació pot augmentar el pic d'excitació de 480nm, convertint la GFP en un company molt més eficient de l'aequorina, evolutivament sembla que A. victoria prefereix l'espectre d'excitació de doble pic, menys eficient. Roger Tsien ha especulat que la pressió hidroestàtica variable amb la profunditat pot afectar la capacitat de la serina 65 de cedir un hidrogen al cromòfor i canviar la relació dels dos pics d'excitació. Així, les meduses poden canviar el color de la seva bioluminescència amb la profunditat. Per desgràcia, un col·lapse en la població de meduses a Friday Harbor, on es va descobrir originalment la GFP, ha impedit estudiar més a fons el paper de la GFP en el medi natural de la medusa.
Derivats A causa del potencial d'ús generalitzat i de l'evolució de les necessitats dels investigadors, han estat dissenyats molts mutants diferents de la GFP. La principal millora va ser la determinació d'un únic punt de mutació (S65T), reportat el 1995 a la revista Nature per Roger Tsien. Aquesta mutació va millorar molt les característiques espectrals de la GFP, provocant un augment de la fluorescència, fotoestabilitat i un desplaçament del pic d'excitació major a 488nm amb el pic d'emissió mantingut a 509nm. Això coincidia amb les característiques espectrals dels conjunts de filtre FITC habitualment disponibles, augmentant el practicatge del seu ús per a la investigació en general. El 1995 el laboratori d'Ole Thastrup va descobrir un punt d'eficiència de plegament a 37 °C (F64L) que permetia la mutació de la GFP a la EGFP (enhanced green fluorescent protein). La EGFP obrí l'ús de la GFP en cèl·lules de mamífers. Té un coeficient d'extinció (ε) de 55,000 M−1cm−1. El rendiment quàntic de fluorescència (QY) de la EGFP és de 0,60. La brillantor relativa, expressada com a ε · QY, és 33000 M−1cm−1. La GFP superplegada, una sèrie de mutacions que permeten a la GFP plegar-se ràpidament i madurar fins i tot quan es fusiona amb pèptids poc plegats, es va donar a conèixer el 2006. miniatura|Proteïnes de la membrana dels llevats
S'han fet moltes altres mutacions, inclosos els mutants de color; en particular, la proteïna blava fluorescent (EBFP, EBFP2, atzurita, mKalama1), la proteïna fluorescent cian (ECFP, Cerulean, CyPet) i derivats de la proteïna fluorescent groga (YFP, citrí, Venus, YPet). Derivats de la BFP (excepte mKalama1) contenen la substitució Y66H. La mutació crítica en derivats cian és la substitució Y66W, que fa que el cromòfor formi un component indol en lloc dels fenòlics. Diverses mutacions addicionals compensatòries són necessàries per restaurar la brillantor a aquest cromòfor modificat degut a l'augment de grups indol. La longitud d'ona desplaçada al vermell dels derivats YFP es du a terme per la mutació T203Y i es deu a les interaccions π-electró acumulades entre els residus de tirosina substituïts i el cromòfor. Aquestes dues classes de variants espectrals s'utilitzen sovint en experiments de transmissió d'energia de ressonància (FRET). Gens genèticament codificats que són sensibles a les molècules de senyalització cel·lular, com el calci o el glutamat, estats de fosforilació de proteïnes, la complementació proteica i la dimerització del receptor, entre altres processos, ofereixen lectures òptiques altament específiques de l'activitat cel·lular en temps real.
Mutagènesis semiracionals d'una sèrie de residus portaren al desenvolupament de mutants sensibles al pH, coneguts com a pHluorins, i més tard, pHluorins súper-eclíptics. Mitjançant l'aprofitament dels ràpids canvis en el pH en la fusió de vesícules sinàptiques, s'han utilitzat pHluorins agregats a sinaptobrevina per visualitzar l'activitat sinàptica en les neurones.
Versions sensibles a les reaccions redox de la GFP (roGFP) van ser dissenyades mitjançant la introducció de cisteïnes en l'estructura de barril beta. L'estat redox de les cisteïnes determina les propietats fluorescents de la roGFP.
La nomenclatura de les GFP modificades és sovint confusa a causa de la superposició de diverses versions de la GFP en un sol nom. Per exemple, mGFP s'acostuma a referir a una GFP amb una palmitoilació N-terminal que fa que la GFP s'uneixi a les membranes cel·lulars. No obstant això, el mateix terme s'utilitza també per referir-se a les GFP monomèriques, que sovint s'aconsegueixen amb la mutació A206K i la ruptura de la interfície del dímer. La GFP de tipus salvatge té una tendència feble a la dimerització a concentracions superiors a 5mg/ml. mGFP també significa "GFP modificada", que ha estat optimitzada a través de l'intercanvi d'aminoàcids per assolir una expressió estable en cèl·lules vegetals.
Dins aquest context, cal assenyalar els treballs del científic rus Sergey Lukyanov i els seus col·laboradors, els quals descobriren la presència de proteïnes similars a la GPF en coralls. En el gènere Discosoma trobaren una proteïna fluorescent vermella, la DsRed, que va esdevenir molt important, ja que, fins aleshores, la gamma de colors que s'havia aconseguit només anava del blau al groc. Fou el laboratori de Tsien el qui utilitzà l'enginyeria genètica per obtenir una versió monomèrica de la DsRed, que en estat natural és un tetràmer.