Kolera-toksin (također poznat kao kolerin toksin i koleragen, CTX, CTx i CT) je snažan enterotoksin koji proizvodi bakterija Vibrio cholerae, a uzrokuje tešku vodenastu dijareju i dehidraciju koji definiraju infekcije kolerom. Toksin je član porodice enterotoksina labilnih na toplinu i postoji kao multimerni toksin AB5 s jednom enzimski aktivnom A podjedinicom i pet B podjedinica koje se vežu za receptore, a koje olakšavaju ulazak u ćeliju domaćina.
Historija
Vibrio cholerae koji proizvode toksin kolere su uzročni patogeni agens drevne bolesti kolera, prvobitno pronađene u Aziji i Evropi. Prva moderna globalna pandemija pojavila se u delti Gangesa 1817. godine. Globalizacija koja se razvijala u devetnaestom stoljeću proširila ju je svijetom tokom sedam uzastopnih pandemijskih godina. Kada je kolera stigla u London, 1832. godine, njen prijenos nije bio dobro shvaćen, a mnogi su krivili mijazmu. Ljekar, John Snow (1813–1858), bio je zagovornik kontaminacije vode kao uzroka njenog širenja – poznato je okončavajući epidemiju uklanjanjem ručke javne pumpe za vodu u centru Londona. Međutim, njegova teorija je prihvaćena tek godinama nakon njegove smrti, otkrićem bakterije Vibrio cholerae.
Otkriće i izolacija Otkriće toksina kolere se široko pripisuje Robertu Kochu, ljekaru i mikrobiologu. Koch je 1886. godine postavio hipotezu da Vibrio cholerae proizvodi supstancu koja uzrokuje simptome kolere. Međutim, izolaciju bakterije već je 30 godina ranije proveo italijanski anatom Fillippo Pacini, koji je potom objavio svoj rad na svom maternjem jeziku.
Godine 1951, Sambhu Nath De je potvrdio Kochovu hipotezu kroz Deovo istraživanje koje je uključivalo ubrizgavanje toplotom ubijene V. cholerae u kuniće. Iz ovog eksperimenta je utvrdio da se endotoksin oslobađa kako se bakterija raspada i da je taj endotoksin odgovoran za simptome bolesti. Zatim je 1959. godine De izveo sljedeći eksperiment, ubrizgavajući filtrat kulture "V. cholerae" bez bakterija u tanko crijevo kunića i time dokazujući postojanje toksina kolere nakupljanjem tekućine.
Pročišćavanje i mehanizam U sljedećoj deceniji, istraživački tim Richarda Finkelsteina uspješno je izolovao i pročistio toksin kolere (CT). Ovo istraživanje je identifikovalo holotoksin (AB5) kao primarni aktivni agens, dok B5 oligomer nije imao unutrašnju toksičnost, ali je igrao ključnu ulogu u izazivanju simptoma kolere. Naknadne biohemijske metode potvrdile su složenu strukturu podjedinica toksina, što je dovelo do našeg trenutnog sveobuhvatnog razumijevanja njegovih mehanizama.
Još jedna značajna prekretnica dogodila se 1973. godine kada su King i van Heyningen identifikovali gangliozid GM1 kao CT receptor. Njihovi eksperimenti su otkrili da GM1 blokira sposobnost toksina da poboljša propusnost kapilara u koži kunića, sprječavajući nakupljanje tečnosti u ligiranim crijevnim petljama kunića. Osim toga, otkrili su da receptor ometa njegov učinak na put adenilil-ciklaze u crijevnom tkivu zamorca. Ovi nalazi bi pomogli u budućim istraživanjima medicinske primjene toksina, kroz sve detaljnije poznavanje njegovih funkcionalnih sposobnosti.
Moderna relevantnost Moderni sanitarni objekti su gotovo u potpunosti uklonili koleru iz industrijaliziranih zemalja, za razliku od ekonomski nerazvijenih regija gdje bolest godišnje odnosi preko 100.000 smrtnih slučajeva. Bolest prvenstveno pogađa ljude koji žive u područjima s neadekvatnom sanitacijom vode, kontinuiranim sukobima i ograničenim pristupom zdravstvenoj zaštiti. Istaknuti primjer je zemljotres na Haitiju 2010., koji je izazvao najgoru modernu epidemiju kolere nakon 10-mjesečnog perioda zakašnjenja.
Trenutno je zabilježeno preko 200 serotipova V. cholerae, od kojih samo serotip O1 i O139 dovode do epidemijskih bolesti, dok se serotipovi koji uzrokuju sporadične epidemije nazivaju ne-O1/ne-O139 V. cholerae. Serogrupa O1 ima dva različita biotipa, naime El Tor i klasični, i bila je uzrok svih sedam pandemija. O1 El Tor (soj 16961) je u velikoj mjeri zamijenio klasični biotip tokom početka sedme pandemije 1960-ih. Nadalje, serogrupa O139 pojavila se 1992. godine i ostaje rasprostranjena i danas.
Klinički i uticaj na javno zdravlje Toksin kolere, glavni štetni faktor Vibrio cholerae, uzrokuje vodenasti proljev, koji postaje fatalan u roku od nekoliko sati ako se ne liječi. Svjetska zdravstvena organizacija prijavila je više od 730.000 slučajeva kolere i 5.100 smrtnih slučajeva u 33 zemlje od januara do novembra 2024. Povećana proizvodnja vakcina nije riješila problem stalne nestašice oralnih vakcina protiv kolere, što otežava programe preventivne vakcinacije. Istraživanja pokazuju da endemske zemlje imaju 2,9 miliona slučajeva kolere, ali zvanični podaci vjerovatno potcjenjuju stvarni broj slučajeva. Brojevi pokazuju dvostruku ulogu toksina u tome što kolera predstavlja i kritično medicinsko stanje i značajnu zabrinutost za javno zdravlje.
Struktura alt=|thumb|3D struktura toksina kolere: Zelena regija na vrhu predstavlja enzimski aktivnu A podjedinicu (ctxA), dok višebojna regija koja formira prsten na dnu predstavlja pentamernu B podjedinicu (ctxB), odgovornu za vezivanje za ćeliju domaćina. Toksin kolere je klasični AB5-tip heksamerni protein sastavljen od jedne enzimski aktivne A podjedinice i pet identičnih B podjedinica koje se vežu za receptor. Ova struktura veoma podsjeća na termolabilni enterotoksin (LT) koji proizvodi Escherichia coli, a njegove značajne sličnosti u sekvenci i funkciji potvrđuju njegovo zajedničko članstvo u porodici toksina AB5.
Podjedinica (UniProt: P01555) sadrži 240 aminokiselina i teži približno 28 kDa. Proteolitički se cijepa u dva različita domena. CTA1 (~22 kDa), enzimski aktivni globulasti domen. I, CTA2 (~5,5 kDa), dugačka alfa-heliks koja veže CTA1 za prsten B podjedinice.
Ovi domeni povezani su putem disulfidne veze između Cys187 i Cys199. CTA1 domen katalizira ADP-ribozilaciju Arg201 na Gsα podjedinici heterotrimernih G-proteina. Ovo zaključava adenilil-ciklazu u aktivnom stanju, podižući nivoe cAMP i pokrećući karakterističnu sekreciju tečnosti koja se vidi kod kolere. Katalitski ostatak unutar CTA1 je Glu112, smješten u klinastom naboru sastavljenom od dva β-lista i nekoliko heliksa.CTA2 domen prolazi kroz centralnu poru pentamera B podjedinice i završava u KDEL sekvenci (Lys-Asp-Glu-Leu), što olakšava endoplazmatski retikulum (ER) zadržavanje tokom retrogradnog transporta, iako nije strogo neophodno za transport. Da bi se CTA1 translocirao u citosol i postao aktivan, disulfidna veza mora biti reducirana u ER. CTA1 zatim prolazi kroz djelimično rasklapanje i preuzima ER-povezanu degradaciju (ERAD) put za izvoz u citosol. Njegov nizak sadržaj lizina pomaže mu da izbjegne ubikvitinizaciju i degradaciju, omogućavajući mu da se ponovo savije i ispolji toksičnost. Svaka B podjedinica (UniProt: P01556) sastoji se od 103 aminokiseline i teži približno 11 kDa nakon cijepanja signalnog peptida. Pet B podjedinica formira pentamerni prsten u obliku krofne koji se specifično veže za GM1 gangliozidne receptore na površini crijevnih epitelnih ćelija. Vezivanje je poboljšano kooperativnošću među podjedinicama, što olakšava endocitozu i naknadni retrogradni transport kroz Golgijev aparat i ER.Trodimenzijska struktura holotoksina određena je 1995. godine od strane Zhanga i saradnika koristeći rendgensku kristalografiju pri rezoluciji od 2,5 Å (PDB: 1XTC) The Hol group determined it again at a 1.9 Å resolution, yielding a much improved geometry compared to the first structure determination.
Patogeneza thumb|Mehanizam djelovanja kolerinog toksina Kolerni toksin (CT) inicira svoje toksične efekte vezivanjem za GM1 gangliozidne receptore na površini crijevnih epitelnih ćelija putem svog pentamera, podjedinice B. Ako GM1 nije prisutan ili je rijedak, CT može stupiti u interakciju s alternativnim fukoziliranim glikokonjugatima, kao što su Lewis X i Lewis Y antigeni, proširujući svoj kapacitet vezivanja za domaćina.
Nakon što se veže, cijeli holotoksin se endocitozira i podliježe retrogradnom transportu kroz Golgijev aparat do endoplazmatskog retikuluma (ER). U ER-u, A podjedinica (CTXA) se cijepa proteazama na CTA1 i CTA2, koji ostaju povezani disulfidnom vezom između Cys187 i Cys199. ER-rezidentna oksidoreduktaza protein disulfid izomeraza (PDI), uz pomoć Ero1, reducira ovu vezu, oslobađajući katalitski aktivni CTA1 domen.
CTA1 se djelomično rasklapa i koristi put degradacije povezan s ER-om (ERAD) za translokaciju u citosol putem Sec61 translokona. Za razliku od tipičnih ERAD supstrata, CTA1 izbjegava ubikvitinizaciju zbog niskog sadržaja lizina, što mu omogućava ponovno savijanje u citosolu umjesto da ga proteasom razgradi.
CTA1 se veže za ARF6-GTP (ADP-ribozilacijski faktor 6) u citosolu, što inducira konformacijsku promjenu koja otkriva njegovo aktivno mjesto. CTA1 zatim katalizira ADP-ribozilaciju Arg201 na Gαs podjedinici heterotrimernih G-proteina, koristeći NAD+ kao supstrat. Ova posttranslacijska modifikacija inhibira hidrolizu GTP-a, zaključavajući Gsα u njegovom aktivnom GTP-vezanom stanju i kontinuirano stimulirajući adenilil-ciklazu.
Ovo dramatično povećava nivoe unutarćelijskogg 3',5'-cikličnog AMP-a (cAMP), aktivirajući protein kinazu A (PKA). PKA fosforilira i aktivira hloridne kanale CFTR, promovirajući lučenje Cl-, HCO<sub>3</sup>-, Na+ i vode u crijevni lumen. Osim toga, inhibira se unos Na+ i vode od strane enterocita, što rezultira karakterističnom obilnom vodenastom dijarejom (do 1–2 litra na sat), doprinoseći teškoj dehidraciji i elektrolitnom disbalansu kod pacijenata sa kolerom. Sličan mehanizam je uočen kod pertussis toksin akoji proizvodi Bordetella pertussis, još jedan član AB5 porodice. Međutim, umjesto da cilja Gsα, pertussis toksin ADP-ribozilira Giα podjedinicu, sprječavajući je da inhibira adenilil-ciklazu. To, zauzvrat, dovodi do povećanja nivoa cAMP-a putem različitog, ali povezanog mehanizma..
Porijeklo Gen toksina kolere ('ctxAB) je uveden u V. cholerae putem horizontalnog transfera gena putem virusa poznatog kao CTXφ bakteriofag. Virulentni Sojevi V. cholerae (serogrupa O1 i O139) sadrže integrirane gene iz ovog bakteriofaga, uključujući ctxAB i druge gene faga. Nadalje, integrirani CTXφ genom dijeli gene sa svojim satelitskim fagom, RS1, uključujući:
Replikacija (RstA), Integracija (RstB) Regulacija: sprječavanje represije replikacije CTXφ (RstC), regulacija ekspresije gena (RstR), Pakovanje i sekrecija faga geni (Psh, Cep, OrfU, Ace i Zot), koji dijele strukturnu homologiju sa Ff filamentoznim kolifagom.
Ovi geni omogućavaju replikaciju i sekreciju bakteriofaga CTXφ bez potrebe za ekscizijom profaga iz originalne bakterije domaćina. Kao rezultat toga, fag može horizontalno prenijeti gen koji kodira CTX na druge osjetljive ćelije zajedno s ostatkom genoma faga.
Primjena B podjedinica toksina kolere (CTB) je relativno netoksična, što je čini vrijednim alatom u ćelijskoj i molekulskoj biologiji. Često se koristi kao neuronski traser zbog svoje sposobnosti vezivanja GM1 gangliozida na ćelijske membrane, što omogućava vizualizaciju neuronskih puteva.
Pored toga, u istraživanju nervnih matičnih ćelija, uočeno je da CTB utiče na lokalizaciju transkripcijskog faktora Hes3.
Vakcina Trenutno su dostupne dvije vakcine protiv kolere: Dukoral i Shanchol. Obje vakcine koriste cijele ubijene V. cholerae ćelije, međutim, Dukoral također sadrži rekombinantni kolerin toksin β (rCTB). Neke studije sugeriraju da uključivanje rCTB-a može poboljšati efikasnost vakcine kod male djece (2-10) i produžiti trajanje zaštite. Međutim, za razliku od Shanchola, uključivanje rCTB-a u vakcine povećava troškove proizvodnje i zahtijeva stroge uslove skladištenja kako bi se spriječila degradacija.
Adjuvant vakcine