thumb|Mikrografija Gram-pozitivnog kokusa i Gram-negativnog štapića. thumb| Gramov metod bojenja miješanih bakterija Staphylococcus aureus (S. aureus ATCC 25923, Gram-pozitivna bakterija|Gram-poizivne koke, ljubičaste boje) i Escherichia coli (E. coli ATCC 11775, Gram-negativnih bacila, crvene boje), najčešće referentne bakterije za Gramovo bojenje
Gramova metoda (Gramovo bojenje ili Gramov metod) je naćin bojenja koji se koristi za klasifikaciju vrsta bakterija u dvije velike grupe: Gram-pozitivne i Gram-negativne bakterije. Može se koristiti i za dijagnosticiranje gljivične infekcije. Naziv potiče od danskog bakteriologa Hansa Christiana Grama, koji je razvio tehniku 1884.
Gramovo bojenje razlikuje bakterije prema hemijskim i fizičkim svojstvima njihovih ćelijskih zidova. Gram-pozitivne ćelije imaju debeli sloj peptidoglikana u ćelijskom zidu koji zadržava primarnu boju, kristal ljubičastu. Gram-negativne ćelije imaju tanji sloj peptidoglikana koji omogućava ispiranje kristal ljubičaste nakon dodavanja etanola. Boje se ružičasto ili crveno kontrabojom, obično safranin omili fuksinom. Rastvor Lugolovog joda se uvijek dodaje nakon dodavanja kristal ljubičaste kako bi se formirao stabilan kompleks sa kristal ljubičastom, koji jača veze boje sa ćelijskim zidom.
Bojenje po Gramu je gotovo uvijek prvi korak u identifikaciji bakterijske grupe. Iako je bojenje po Gramu vrijedan dijagnostički alat i u kliničkim i u istraživačkim okruženjima, ne mogu se sve bakterije definitivno klasificirati ovom tehnikom. To dovodi do gram-varijabilnih i gram-neodređenih grupa.
Historija Metoda je dobila ime po svom izumitelju, danskom naučniku Hansu Christianu Gramu (1853–1938), koji je razvio tehniku radeći sa Carlom Friedländerom u mrtvačnici gradske bolnice u Berlinu 1884. Gram je osmislio svoju tehniku ne s ciljem razlikovanja jedne vrste bakterija od druge, već da bi bakterije bile vidljivije u obojenim presjecima plućnog tkiva. Gram je primijetio da neke bakterijske ćelije posjeduju značajnu otpornost na promjenu boje. Na osnovu ovih zapažanja, Gram je razvio početni postupak bojenja po Gramu, u početku koristeći Ehrlichovu anilin-encijan ljubičastu, Lugolov jod, apsolutni alkohol za promjenu boje i Bismarck smeđu za kontrastno bojenje. Svoju metodu je objavio 1884. godine i u svoj kratki izvještaj uključio zapažanje da tifusni bacil nije zadržao boju..English translation in: Translation is also at: Gram did not initially make the distinction between Gram-negative and Gram-positive bacteria using his procedure.
Upotreba thumb|right|Gramova metoda bojenja Candida albicans iz vaginskog brisa. Male ovalne hlamidospore su promjera 2–4 μm. Gramova metoda bojenja je bakteriološka laboratorijska tehnika; koristi se za razlikovanje bakterijskih vrsta u dvije velike grupe (Gram-pozitivne i Gram-negativne) na osnovu fizičkih svojstava njihovih ćelijskih zidova. Bojenje po Gramu se također može koristiti za dijagnosticiranje gljivične infekcije. Ne koristi se za klasifikaciju arheja, budući da ovi mikroorganizmi daju vrlo različite odgovore koji ne prate njihove filogenetičke grupe.
Gram bojenje se izvodi na tjelesnoj tekućini ili biopsijsma, kada se sumnja na infekciju. Gram bojenje daje rezultate mnogo brže od mikrobiološke kulture i posebno je važno kada infekcija može značajno uticati na liječenje i prognozu pacijenta; primjeri su cerebrospinalna tekućina za meningitis i sinovijalna tekućina za sepsni artritis.
Mehanizam bojenja thumb| Ljubičasto obojene Gram-pozitivne (lijevo) i ružičasto obojene Gram-negativne (desno) Gram-pozitivne bakterije imaju debeli mrežasti ćelijski zid napravljen od peptidoglikana (50–90% ćelijske ovojnice), te se kao rezultat toga boje ljubičasto kristal ljubičastom bojom, dok gram-negativne bakterije imaju tanji sloj (10% ćelijske ovojnice), pa ne zadržavaju ljubičastu boju i kontrastno se boje ružičasto safraninom. Postoje četiri osnovna koraka bojenja po Gramu: Nanošenje primarne boje (kristal ljubičasta) na razmaz bakterijske kulture fiksiran toplotom. Fiksacija toplotom ubija neke bakterije, ali se uglavnom koristi za pričvršćivanje bakterija na pločicu kako se ne bi isprale tokom postupka bojenja. Dodavanje joda, koji se veže za kristal ljubičastu boju i zadržava je u ćeliji Brza dekolorizacija sa etanolom ili acetonom Kontrastno bojenje sa safraninom. Karbol fuksin se ponekad koristi kao zamjena za safranin jer intenzivnije boji anaerobne bakterije, ali se rjeđe koristi kao kontrastna boja. + Sažetak bojenja po GramuAplikacija Reagens Ćelijska boja Gram-pozitivne Gram-negativne Primarna boja Kristal ljubičasta Ljubičasta Ljubičasta Traper Jod l Ljubičasta Ljubičasta Sredstvo za uklanjanje boje alkohol/aceton Ljubičasta Bezbojna Kontra boja safranin/karbol fuksin ljubičasta Ružičasta ili crvena Kristalno ljubičasta (CV) disocira u vodenim rastvorima na i hloridne () ione. Ovi ioni prodiru u ćelijski zid i Gram-pozitivnih i Gram-negativnih ćelija. ion interreaguje sa negativno naelektrisanim komponentama bakterijskih ćelija i boji ćelije u ljubičasto..
Jodid ( ili ) međureaguje sa i formira velike komplekse kristal ljubičaste boje i joda (CV–I) unutar unutrašnjih i vanjskih slojeva ćelije. Jod se često naziva mordant, ali je sredstvo za hvatanje koje sprječava uklanjanje CV–I kompleksa i stoga boji ćeliju.
Kada se doda sredstvo za uklanjanje boje poput alkohola ili acetona, ono stupa u interakciju s lipidima ćelijske membrane. Gram-negativna ćelija gubi svoju vanjsku lipopolisaharidnu membranu, a unutrašnji sloj peptidoglikana ostaje izložen. CV–I kompleksi se ispiru iz gram-negativne ćelije zajedno s vanjskom membranom. Nasuprot tome, Gram-pozitivna ćelija dehidrira tretmanom etanolom. Veliki CV–I kompleksi ostaju zarobljeni unutar Gram-pozitivne ćelije zbog višeslojne prirode njenog peptidoglikana. Korak obezbojenja je ključan i mora se pravilno tempirati; kristal violet boja se uklanja i sa Gram-pozitivnih i sa Gram-negativnih ćelija ako se sredstvo za obezbojenje ostavi predugo (nekoliko sekundi).
Nakon obezbojenja, Gram-pozitivna ćelija ostaje ljubičasta, a Gram-negativna gubi svoju ljubičastu boju. Kontrastna boja, koja je obično pozitivno nabijeni safranin ili bazni fuksin, nanosi se posljednja kako bi se obezbojenim Gram-negativnim bakterijama dala ružičasta ili crvena boja. == Examples ==
Gram-pozitivne bakterije thumb| Gram-bojenje Gram-pozitivnih streptokoka okruženih gnojnim ćelijama
Gram-pozitivne bakterije uglavnom imaju jednu membranu (monoderma) okruženu debelim peptidoglikanom. Ovo pravilo slijede dva koljena: Bacillota (osim klasa Mollicutes i Negativicutes) i Actinomycetota. Nasuprot tome, članovi Chloroflexota (zelene nesumporne bakterije) su monodermne, ali posjeduju tanak ili odsutan (klasa Dehalococcoidetes) peptidoglikan i mogu se obojiti negativno, pozitivno ili neodređeno; članovi Deinococcota se boje pozitivno, ali su diderme s debelim peptidoglikanom.
Čvrstoća ćelijskog zida je pojačana teihoičnim kiselinama, glikopolimernim supstancama ugrađenim u peptidoglikan. Teihoične kiseline imaju višestruke uloge, kao što su generiranje neto negativnog naboja ćelije, doprinos krutosti ćelijskog zida i održavanju oblika, te pomaganje u diobi ćelija i otpornosti na različite stresore, uključujući toplozu i soli. Uprkos gustoći sloja peptidoglikana, on ostaje relativno porozan, što omogućava prodiranje većine supstanci. Za veće hranjive tvari, Gram-pozitivne bakterije koriste egzoenzime, koji se luče vanćelijski, kako bi razgradile makromolekule izvan ćelije.
Historijski gledano, Gram-pozitivni oblici su činili koljeno Firmicutes, naziv koji se sada koristi za najveću grupu. Uključuje mnoge poznate rodove kao što su Lactobacillus, Bacillus, Listeria, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus i Clostridium. Također je proširen i na Mollicutes, bakterije poput Mycoplasma i Thermoplasma koje nemaju ćelijske zidove i stoga se ne mogu bojeti po Gramu, ali su izvedene iz takvih oblika.
Neke bakterije imaju ćelijske zidove koji su posebno sposobni u zadržavanju boja. One će izgledati pozitivne Gramovom metodom bojenja iako nisu blisko povezane s drugim Gram-pozitivnim bakterijama. One se nazivaju kiselootporne bakterije i mogu se razlikovati od drugih Gram-pozitivnih bakterija samo posebnim postupcima bojenja.
Gram-negativne bakterije
right|thumb| Gram negativne Neisseria gonorrhoeae i gnojne ćelije Gram-negativne bakterije uglavnom posjeduju tanki sloj peptidoglikana između dvije membrane (diderma). Lipopolisaharid (LPS) je najzastupljeniji antigen na površini ćelija većine Gram-negativnih bakterija, čineći do 80% vanjske membrane E. coli i roda Salmonella. Ove LPS molekule, koja se sastoje od O-antigena ili O-polisaharida, središnjeg polisaharida i lipida A, imaju višestruke funkcije, uključujući doprinos negativnom naboju ćelije i zaštitu od određenih hemikalija. Uloga LPS-a je ključna u interakcijama domaćina i patogena, pri čemu O-antigen izaziva imunski odgovor, a lipid A djeluje kao endotoksin.
Osim toga, vanjska membrana djeluje kao selektivna barijera, regulirana porinima, transmembranskim proteinima, koji formiraju pore koje omogućavaju prolaz određenih molekula. Prostor između ćelijske i vanjske membrane, poznat kao periplazma, sadrži periplazmatske enzime za obradu hranjivih tvari. Značajna strukturna komponenta koja povezuje peptidoglikanski sloj i vanjsku membranu je Braunov lipoprotein, koji pruža dodatnu stabilnost i čvrstoću bakterijskom ćelijskom zidu.
Većina bakterijskih koljena su Gram-negativne, uključujući cijanobakterije, zelene sumporne bakterije i većinu Pseudomonadota (izuzeci su neki članovi Rickettsiales i insekti-endosimbionti Enterobacteriales).
Gram-varijabilne i Gram-neodređene bakterije Neke bakterije, nakon bojenja Gram bojom, daju Gram-varijabilni uzorak: vidi se mješavina ružičastih i ljubičastih ćelija. U kulturama Bacillus, Butyrivibrio i Clostridium, smanjenje debljine peptidoglikana tokom rasta podudara se s povećanjem broja ćelija koje boje Gram-negativne bakterije. Osim toga, kod svih bakterija obojenih Gram bojom, starost kulture može utjecati na rezultate bojenja.
Gram-neodređene bakterije ne reaguju predvidljivo na Gramovo bojenje i stoga se ne mogu odrediti ni kao Gram-pozitivne ni kao Gram-negativne. Primjeri uključuju mnoge vrste Mycobacterium, uključujući Mycobacterium bovis, Mycobacterium leprae i Mycobacterium tuberculosis, od kojih su posljednje dvije uzročnici lepre i tuberkuloze. Bakterije roda Mycoplasma nemaju ćelijski zid oko svojih ćelijskih membrana, što znači da se ne boje Gramovom metodom i otporne su na antibiotike koji ciljaju sintezu ćelijskog zida. Ortografska napomena Termin Gramovo bojenje potiče od prezimena Hans Christian Gram; eponim (Gram) se stoga piše velikim slovom, ali ne i zajednička imenica (boja) kao što je uobičajeno za naučne termine. Početna slova riječi gram-pozitivni i gram-negativni, koja su eponimni pridjevi, mogu biti veliko G ili malo g, ovisno o tome koji stilski vodič (ako postoji) reguliše dokument koji se piše. Stil s malim slovima koriste američki Centri za kontrolu i prevenciju bolesti i drugi stilski režimi kao što je AMA stil. Također pogledajte Struktura bakterijske ćelije Ziehl-Neelsenova boja
Reference
Vanjski linkovi
Gram staining technique video
Kategorija:Bakteriologija Kategorija:Mikrobiologija Kategorija:Mikroskopija Kategorija:Boje Kategorija:1884. u biologiji