thumb|Dvostruka spirala DNK

DNK-profiliranje je određivanje DNK-profila u pravne i istražne svrhe. Metodi analize DNK su se tokom godina mijenjale bezbroj puta kako se tehnologija mijenja i omogućava određivanje više informacija, s manje početnog materijala. Moderna analiza DNK zasniva se na statističkom proračunu rijetkosti proizvedenog profila unutar populacije.

Iako je najpoznatija kao alat u forenzičkim istragama, DNK profiliranje se može koristiti i u neforenzičke svrhe kao što su testiranje očinstva i ljudska genealoška istraživanja. Historija Metodie za izradu DNK profila razvili su Alec Jeffreys i njegov tim 1985. godine. Jefferys je otkrio da se nepoznati uzorak DNK poput krvi, dlaka, pljuvčke ili sperme može analizirati i razviti jedinstveni DNK obrazac/profil.. Godinu dana nakon otkrića, Jefferys je zamoljen da upotrijebi svoju novootkrivenu DNK analizu kako bi osudio čovjeka za kojeg je policija vjerovala da je odgovoran za dva silovanja i ubistva. Jefferys je dokazao da je čovjek nevin, koristeći DNK s mjesta zločina.

Kada je DNK analiza prvi put otkrivena, za analizu korišten je proces nazva Polimorfizam dužine restrikcijskih fragmenata (RFLP). Međutim, RFLP je bio neefikasan proces, zbog činjenice da je koristio velike količine DNK koje se nisu uvijek mogle dobiti s mjesta zločina. Moderna tehnologija je evoluirala dalje od RFLP-a. Analiza kratkih tandemskih ponavljanja (STR) je moderni ekvivalent RFLP-a. STR analiza ne samo da koristi manje uzorka za analizu DNK, već je i dio većeg procesa koji se naziva Lančana reakcija polimeraze (PCR). PCR je proces koji se može koristiti za brzu reprodukciju do milijardu kopija pojedinačnog segmenta DNK..

Metodi

Umirovljeni metodi

Analiza RFLP thumb|right| Šest osoba s različitim brojem ponavljanja na jednoj lokaciji u njihovom genomu prikazano je na gelu.

Prvi prav metod profiliranja DNK bila je analiza polimorfizma dužine restrikcijskih fragmenata. Prva upotreba RFLP analize u forenzičkom radu bila je 1985. godine u Ujedinjenom Kraljevstvu. Ova vrsta analize koristila je varijabilni broj tandemskih ponavljanja (VNTR) za razlikovanje osoba. VNTR su uobičajeni u cijelom genomu i sastoje se od iste DNK sekvence koja se ponavlja iznova i iznova. Različite osobe mogu imati različit broj ponavljanja na određenoj lokaciji u genomu. Naprimjer, osoba A mogla bi imati čtiri, dok bi osoba B mogla imati pet ponavljanja. Razlike su vizualizirane procesom koji se naziva gel elektroforeza. Manji fragmenti bi putovali dalje kroz gel od većih fragmenata koji bi ih razdvajali. Ove razlike su korištene za razlikovanje pojedinaca i kada je više VNTR mjesta provedeno zajedno, RFLP analiza ima visok stepen individualizacijske moći.

Proces RFLP analize je bio izuzetno dugotrajan i zbog dužine korištenih ponavljanja, između devet i 100 baznih parova, metoda amplifikacije poput lančane reakcije polimeraze nisu se mogle koristiti. Ovo je ograničilo RFLP na uzorke koji su već imali veću količinu DNK dostupne za početak i nisu dobro funkcionirali sa degradiranim uzorcima. RFLP analiza je bila primarna vrsta analize koja se izvodila u većini forenzičkih laboratorija prije nego što je konačno povučena i zamijenjena novijim metodama. FBI ga je u potpunosti napustio 2000. godine i zamijenio STR analizom.

DQ alfa testiranje

thumb|right|DQ alfa testna traka koja pokazuje pozitivan rezultat. Popunjene tačke predstavljaju vrijednosti alela za taj uzorak.

Razvijeno 1991. godine, DQ alfa testiranje bila je prva forenzička DNK tehnika koja je koristila lančanu reakciju polimeraze. Ova tehnika je omogućila korištenje mnogo manje ćelija od RFLP analize, što je čini korisnijom za mjesta zločina koja nisu imala velike količine DNK materijala koji je ranije bio potreban. DQ alfa 1 lokus (ili lokacija) je također bio polimorfan i imao je više različitih alela, koji su se mogli koristiti za ograničavanje broja pojedinaca koji su mogli proizvesti taj rezultat i povećanje vjerovatnoće isključenja.

DQ alfa lokus je kombinovan sa drugim lokusima u komercijalno dostupnom kompletu pod nazivom Polymarker 1993. godine. Polimarker je bio preteča modernog multipleksiranja kompleti i omogućili su ispitivanje više različitih lokusa jednim proizvodom. Iako je bio osjetljiviji od RFLP analize, polimarker nije imao istu diskriminatornu moć kao starije RFLP testiranje. Do 1995. godine, naučnici su pokušali da se vrate analizi zasnovanoj na VNTR-u u kombinaciji sa PCR tehnologijom koja se naziva polimorfizmi dužine amplifikovanog fragmenta (AmpFLP). AmpFLP thumb|right| agarozni gel koja prikazuje lokus D1S80 provedena je u više traka korištenjem AmpFLP-a.

AmpFLP je bio prvi pokušaj spajanja VNTR analize s PCR-om za forenzičke slučajeve. Ova metoda koristila je kraće VNTR-ove od RFLP analize, između osam i 16 baznih parova. Kraće veličine baznih parova AmpFLP-a dizajnirane su da bolje funkcioniraju s procesom amplifikacije PCR-a. Nadalo se da će ova tehnika omogućiti diskriminirajuću moć RFLP analize s mogućnošću obrade uzoraka koji imaju manje DNK matrice za rad ili koji su na drugi način degradirani. Međutim, samo je nekoliko lokusa validirano za forenzičke primjene za rad s AmpFLP analizom, jer su forenzičke laboratorije brzo prešle na druge tehnike, što je ograničilo njenu sposobnost razlikovanja forenzičkih uzoraka. Tehnika na kraju nikada nije široko korištena, iako se i dalje koristi u manjim zemljama zbog niže cijene i jednostavnijeg postavljanja u usporedbi s novijim metodima. Do kraja 1990-ih, laboratorije su počele prelaziti na novije metode, uključujući STR analizu. One su koristile još kraće fragmente DNK i mogle su se pouzdanije amplificirati pomoću PCR-a, a istovremeno su zadržale i poboljšale diskriminatornu moć starijih metoda.

Sadašnje metode

STR analiza

thumb|right|Djelomični elektroferogram dobiven STR analizom.

Analiza kratkih tandemskih ponavljanja (STR) je primarna vrsta forenzičke DNK analize koja se izvodi u modernim DNK laboratorijama. STR analiza se nadovezuje na RFLP i AmpFLP koji su se koristili u prošlosti smanjenjem veličine ponavljajućih jedinica na dva do šest baznih parova i kombiniranjem više različitih lokusa u jednu PCR reakciju. Ovi multipleksirajući testovi mogu proizvesti vrijednosti alela za desetine različitih lokusa u genomu, istovremeno ograničavajući vrijeme potrebno za dobijanje potpunog, individualizirajućeg profila. STR analiza je postala zlatni standard za DNK profiliranje i široko se koristi u forenzičkim primjenama.

Analiza STR se također može ograničiti samo na hromosom Y. Y-STR analiza se može koristiti u slučajevima koji uključuju očinstvo ili u porodičnom pretraživanju jer je Y hromosom identičan niz očinsku liniju (osim u slučajevima kada je došlo do mutacije). Određeni multipleksni kompleti kombiniraju i autosomne i Y-STR lokuse u jedan komplet, što dodatno smanjuje vrijeme potrebno za dobijanje velike količine podataka. Danas, STR analiza zahtijeva više ćelija za kreiranje potpunog DNK profila. Međutim, nauka se sve više približava kreiranju potpunog DNK profila korištenjem STR analize na pojedinačnim ćelijama.

Sekvenciranje mtDNK

Sekvenciranje DNK mitohondrija je specijalizirana tehnika koja koristi odvojenu mitohondrijsku DNK prisutnu u većini ćelija. Ova DNK se prenosi majčinom linijom i nije jedinstvena između pojedinaca. Međutim, zbog broja mitohondrija prisutnih u ćelijama, analiza mtDNK može se koristiti za visoko degradirane uzorke ili uzorke gdje analiza STR ne bi dala dovoljno podataka da bi bila korisna. mtDNK je također prisutna na mjestima gdje bi autosomna DNK bila odsutna, kao što je u vlasima kose.

Zbog povećanih vjerovatnoća kontaminacije pri radu s mtDNK, malo laboratorija obrađuje mitohondrijske uzorke. One koje imaju imaju specijalizirane protokole koji dodatno odvajaju različite uzorke jedne od drugih kako bi se izbjegla unakrsna kontaminacija.

Brza DNK

Brza DNK je tehnologija "bris unutra - profil van" koja potpuno automatizira cijeli proces ekstrakcije, amplifikacije i analize DNK. Instrumenti za brzu DNK analizu (rapid DNK) mogu preći s brisa na DNK profil za samo 90 minuta i eliminiraju potrebu za obučenim naučnicima za izvođenje procesa. Ovi instrumenti se razmatraju za upotrebu u procesu evidentiranja počinilaca, omogućavajući policijskim službenicima da dobiju DNK profil uhapšene osobe. Nedavno je u Sjedinjenim Američkim Državama usvojen Zakon o brzoj DNK analizi iz 2017., kojim se FBI-u nalaže da kreira protokole za implementaciju ove tehnologije širom zemlje. Trenutno, DNK dobijena ovim instrumentima nije podobna za otpremanje u nacionalne DNK baze podataka jer ne analiziraju dovoljno lokusa da bi ispunili standardni prag. Međutim, više policijskih agencija već koristi instrumente za brzu analizu DNK, za prikupljanje uzoraka od osoba uhapšenih u njihovom području. Ove lokalne baze podataka DNK nisu podložne saveznim ili državnim propisima.

Masovno paralelno sekvenciranje

Poznato i kao sekvenciranje sljedeće generacije, masovno paralelno sekvenciranje (MPS) nadograđuje se na STR analizu uvođenjem direktnog sekvenciranja lokusa. Umjesto broja ponavljanja prisutnih na svakoj lokaciji, MPS bi naučniku dao stvarnu sekvencu baznog para. Teoretski, MPS ima sposobnost razlikovanja identičnih blizanaca jer bi se slučajne tačkaste mutacije vidjele unutar segmenata ponavljanja koje tradicionalna STR analiza ne bi otkrila.

Rijetkost profila Kada se DNK profil koristi na dokazan način, pruža se statistika podudaranja koja objašnjava koliko je profil rijedak unutar populacije. Konkretno, ova statistika je vjerovatnoća da će osoba nasumično odabrana iz populacije imati taj specifični DNK profil. To nije vjerovatnoća da se profil "poklapa" s nekim. Postoji više različitih metoda za određivanje ove statistike i svaku koriste različite laboratorije na osnovu svog iskustva i preferencija. Međutim, proračuni omjera vjerovatnoća postaju preferirani metod u odnosu na druge dvije najčešće korištene metode, slučajni čovjek koji nije isključen i kombinovana vjerovatnoća uključivanja. Statistike podudaranja su posebno važne u interpretaciji mješavine gdje postoji više od jednog doprinositelja DNK profilu. Kada se ove statistike daju u sudnici ili u laboratorijskom izvještaju, obično se daju za tri najčešće rase tog specifičnog područja. To je zato što su se frekvencije alela na različitim lokusima mijenjale na osnovu porijekla pojedincahttps://strbase.nist.gov/training/6_Mixture-Statistics.pdf

Slučajni čovjek nije isključen

Vjerovatnoća dobijena ovim metodom je vjerovatnoća da osoba nasumično odabrana iz populacije ne može biti isključena iz analiziranih podataka. Ovu vrstu statistike podudaranja je lahko objasniti u sudskom okruženju pojedincima koji nemaju naučnu pozadinu, ali također gubi mnogo na diskriminirajućoj moći jer ne uzima u obzir genotip osumnjičenog. Ovaj pristup se obično koristi kada je uzorak degradiran ili sadrži toliko doprinosa da se ne može odrediti pojedinačni profil. Također je koristan za objašnjenje laicima jer je metod dobijanja statistike jednostavna. Međutim, zbog ograničene diskriminirajuće moći, RMNE se općenito ne izvodi osim ako se ne može koristiti nijedna druga metoda. RMNE se ne preporučuje za upotrebu u podacima koji ukazuju na prisustvo mješavine.

Kombinovana vjerovatnoća uključivanja/isključivanja right|thumb| Profil jednog izvora koji prikazuje dva alela na vWA lokusu. right|thumb|Mješavina od tri osobe koja pokazuje četiri alela na lokusu vWA.