thumb|Tok rada na sekvenciranji egzoma: 1. dio. Sekvenciranje egzoma, također poznato kao sekvenciranje cijelog egzoma (WES), je genomska tehnika za sekvenciranje svih proteinskih kodirajućih regija gena u genomu (poznatom kao egzom). Sastoji se od dva koraka: prvi korak je izbor samo podskupa DNK koji kodira proteine. Ove regije poznate su kao egzoni—ljudi imaju oko 180.000 egzona, što čini oko 1% ljudskog genoma, ili približno 30 miliona baznih parova. Drugi korak je sekvenciranje egzonske DNK, korištenjem bilo koje visokopropusne tehnologije sekvenciranja DNK.

Cilj ovog pristupa je identificIranje genetičkih varijanti koje mijenjaju proteinske sekvence, i to po mnogo nižoj cijeni od sekvenciranje cijelog genoma. Budući da ove varijante mogu biti odgovorne i za Mendelovske i za uobičajene poligenske bolesti, poput Alzheimerove bolesti, sekvenciranje cijelog egzoma primjenjuje se i u akademskim istraživanjima i kao klinička dijagnostika thumb|Tok rada na sekvenciranju egzoma: 2. dio.

Motivacija i poređenje s drugim pristupima Sekvenciranje egzoma je posebno efikasno u proučavanju rijetkih Mendelovskih bolesti, jer je efikasan način za identifikaciju genetičkih varijanti u svim genima jedinke. Ove bolesti najčešće uzrokuju vrlo rijetke genetičke varijante koje su prisutne samo kod malog broja individua; nasuprot tome, tehnike poput SNP nizova mogu otkriti samo zajedničke genetičke varijante koje su zajedničke mnogim jedinkama u široj populaciji. Nadalje, budući da su varijante koje uzrokuju teške bolesti mnogo vjerovatnije (ali nipošto isključivo) da se nalaze u sekvenci koja kodira proteine, a sekvenciranje na ovaj način košta daleko manje od 1%, sekvenciranja cijelog genoma, ali i dalje detektira visok prinos relevantnih varijanti.

U prošlosti su klinički genetički testovi birani na osnovu kliničke slike pacijenta (tj. fokusirani na jedan gen ili mali broj za koji se zna da je povezan s određenim sindromom) ili su ispitivali samo određene tipove varijacija (npr. komparativna genomska hibridizacija), ali su pružali konačne genetičke dijagnoze kod manje od polovine svih pacijenata. Sekvenciranje egzoma se sada sve više koristi kao dopuna ovim drugim testovima: kako za pronalaženje mutacija u genima za koje se već zna da uzrokuju bolesti, tako i za identifikaciju novih gena poređenjem egzoma pacijenata sa sličnim karakteristikama.

Tehnička metodologija

Korak 1: Strategije obogaćivanja cilja Metodi obogaćivanja cilja omogućavaju selektivno hvatanje genomskih regija od interesa iz uzorka DNK prije sekvenciranja. Nekoliko strategija obogaćivanja cilja razvijeno je od originalnog opisa metode direktne genomske selekcije (DGS) u 2005.

Iako je opisano mnogo tehnika za ciljano hvatanje, samo je nekoliko njih prošireno na hvatanje cijelih egzoma. Prva strategija obogaćivanja cilja koja je primijenjena na sekvenciranje cijelog egzoma bila je hibridna metoda snimanja zasnovana na nizovima 2007., ali snimanje u rastvoru je steklo popularnost posljednjih godina.

Hvatanje zasnovano na nizovima thumb|In-Solution Capture|Hvatanje u rastvoru. Mikročipovi sadrže jednolančane oligonukleotide sa sekvencama iz ljudskog genoma kako bi se popločalo područje interesa fiksirano za površinu. Genomska DNK se reže kako bi se formirali dvolančani fragmenti. Fragmenti se popravljaju na krajevima, kako bi se dobili tupi krajevi i dodaju se adapteri sa univerzalnim sekvencama za pripremu. Ovi fragmenti se hibridizuju sa oligonukleotidima na mikročipu. Nehibridizovani fragmenti se ispiru i željeni fragmenti se eluiraju. Fragmenti se zatim amplificiraju korištenjem PCR-n-rastvor za hvatanje.

Mikročipovi sadrže jednolančane oligonukleotide sa sekvencama iz ljudskog genoma, kako bi se popločala regija od interesa fiksirana na površinu. Genomska DNK se reže kako bi se formirali dvolančani fragmenti. Fragmenti se popravljaju na krajevima kako bi se dobili tupi krajevi i dodaju se adapteri sa univerzalnim sekvencama za pripremu. Ovi fragmenti se hibridizuju sa oligonukleotidima na mikročipu. Nehibridizovani fragmenti se ispiru i željeni fragmenti se eluiraju. Fragmenti se zatim amplificiraju korištenjem PCR-a.

Roche NimbleGen was first Roche NimbleGen je prvi uzeo originalnu DGS tehnologiju i prilagodio je za sekvenciranje sljedeće generacije. Razvili su Sequence Capture Human Exome 2.1M Array za snimanje ~180.000 kodirajućih egzona. Ovaj metod štedi vrijeme i isplativija je u poređenju sa metodima zasnovanim na PCR-u. Agilent Capture Array i komparativna genomska hibridizacijska mreža su drugi metodi koji se mogu koristiti za hibridno hvatanje ciljnih sekvenci. Ograničenja ove tehnike uključuju potrebu za skupim hardverom, kao i relativno veliku količinu DNK.

Hvatanje u rastvoru Da bi se uhvatile genomske regije od interesa korištenjem hvatanja u rastvoru, sintetizira se skup prilagođenih oligonukleotidnih sondi i hibridizira u rastvoru s fragmentiranim uzorkom genomske DNK. Sonde (obilježene kuglicama) selektivno hibridiziraju s genomskim regijama od interesa, nakon čega se kuglice (sada uključujući fragmente DNK od interesa) mogu izvući i isprati kako bi se uklonio višak materijala. Kuglice se zatim uklanjaju, a genomski fragmenti se mogu sekvencirati, što omogućava selektivno sekvenciranje DNK genomskih regija (npr. egzona) od interesa.

Ovaj metod je razvijen kako bi se poboljšao nači obogaćivanja cilja hibridizacijskog hvatanja. Kod hvatanja u rastvoru (za razliku od hibridnog hvatanja) postoji višak sondi za ciljanje regija od interesa u odnosu na količinu potrebnog predloška. Optimalna veličina cilja je oko 3,5 megabaza i daje odličnu pokrivenost sekvenci ciljnih regija. Preferirani metod zavisi od nekoliko faktora, uključujući: broj baznih parova u regiji od interesa, zahtjeve za očitavanjem na meti, opremu u laboratoriji itd.

Korak 2: Sekvenciranje

Postoji mnogo platformi za sekvenciranje sljedeće generacije sekvenciranja, koje su nastale nakon klasičnih metodologija Sangerovskog sekvenciranja. Ostale platforme uključuju sekvencer Roche 454 i SOLiD sisteme Life Technologies, Ion Torrent i Illuminin Illumina Genome Analyzer II (ukinut) i kasnije instrumente serije Illumina MiSeq, HiSeq i NovaSeq, koji se svi mogu koristiti za masovno paralelno sekvenciranje egzoma. Ovi NGS sistemi sa 'kratkim čitanjem' su posebno pogodni za analizu mnogih relativno kratkih dijelova DNK sekvenci, kao što su pronađeni u ljudskim egzonima.

Poređenje sa drugim tehnologijama Postoje višestruke tehnologije koje identifikuju genetičke varijante. Svaka tehnologija ima prednosti i nedostatke u smislu tehničkih i finansijskih faktora. Dvije takve tehnologije su mikročipovi i sekvenciranje cijelog genoma.

Genotipizacija zasnovana na mikročipovima Mikročipovi koriste hibridizacijske sonde za testiranje prevalencije poznatih DNK sekvenci, stoga se ne mogu koristiti za identifikaciju neočekivanih genetičkih promjena. Nasuprot tome, tehnologije sekvenciranja visokog protoka koje se koriste u sekvenciranju egzoma direktno pružaju nukleotidne sekvence DNK na hiljadama testiranih egzonskih lokusa. Stoga, WES se bavi nekim od trenutnih ograničenja hibridizacijskih genotipizacijskih nizova.

Iako je sekvenciranje egzoma skuplje od tehnologija zasnovanih na hibridizaciji na osnovu uzorka, njegova cijena se smanjuje zbog pada troškova i povećanog protoka sekvenciranja cijelog genoma.

Sekvenciranje cijelog genoma Sekvenciranje egzoma može identificirati samo one varijante pronađene u kodirajućoj regiji gena koje utiču na funkciju proteina. Nije u stanju identificirati strukturne i nekodirajuće varijante povezane s bolešću, koje se mogu pronaći korištenjem drugih metoda kao što je sekvenciranje cijelog genoma. Preostaje 99% ljudskog genoma koji nije pokriven sekvenciranjem egzoma, a sekvenciranje egzoma omogućava sekvenciranje dijelova genoma na najmanje 20 puta više uzoraka u poređenju sa sekvenciranjem cijelog genoma. Za prevođenje identificiranih rijetkih varijanti u kliniku, veličina uzoraka i sposobnost interpretacije rezultata radi postavljanja kliničke dijagnoze ukazuju na to da, s današnjim znanjem u genetici, postoje izvještaji o korištenju sekvenciranja egzoma za pomoć u dijagnozi. Troškovi sekvenciranja egzoma su obično niži od sekvenciranja cijelog genoma.

Analiza podataka Statistička analiza velike količine podataka generiranih iz pristupa sekvenciranja predstavlja izazov. Čak i samo sekvenciranjem egzoma pojedinaca, generira se velika količina podataka i informacija o sekvencama, što zahtijeva značajnu količinu analize podataka. Izazovi povezani s analizom ovih podataka uključuju promjene u programima koji se koriste za poravnavanje i sastavljanje očitavanja sekvenci. Različite tehnologije sekvenciranja također imaju različite stope grešaka i generiraju različite dužine očitavanja, što može predstavljati izazov pri poređenju rezultata s različitih platformi za sekvenciranje.

Lažno pozitivni i lažna negativnostwlažno negativni nalazi povezani su s pristupima genomskog resekvenciranja i predstavljaju kritična pitanja. Razvijeno je nekoliko strategija za poboljšanje kvaliteta egzomskih podataka, kao što su:

Poređenje genetičkih varijanti identifikovanih između sekvenciranja i genotipizacije zasnovane na nizovima Poređenje kodirajućih SNP-ova sa sekvenciranim cijelim genomom osobe sa poremećajem Poređenje kodirajućih SNP-ova sa Sanger sekvenciranjem HapMap osoba

Rijetki recesivni poremećaji možda nemaju jednonukleotidne polimorfizme (SNP-ove) u javnim bazama podataka, kao što je dbSNP. Češći recesivni fenotipovi bi imali veću vjerovatnoću da imaju varijante koje uzrokuju bolest prijavljene u dbSNP. Naprimjer, najčešća varijanta cistast fibroze ima frekvenciju alela od oko 3% u većini populacija. Isključivanje takvih varijanti moglo bi pogrešno isključiti takve gene iz razmatranja. Geni za recesivne poremećaje obično se lakše identificiraju od dominantnih poremećaja jer je manja vjerovatnoća da će geni imati više od jedne rijetke nesinonimne varijante. Sistem koji pregleda uobičajene genetičke varijante oslanja se na dbSNP koji možda nema tačne informacije o varijaciji alela. Korištenje spiskova uobičajenih varijacija iz egzoma studije ili sekvencirane jedinke na nivou cijelog genoma bilo bi pouzdanije. Izazov u ovom pristupu je taj što će se, kako se broj sekvenciranih egzoma povećava, dbSNP također povećavati u broju neuobičajenih varijanti. Bit će potrebno razviti pragove za definiranje uobičajenih varijanti koje vjerojatno nisu povezane s fenotipom bolesti.

Genetička heterogenost i populacijska etnička pripadnost također su glavna ograničenja jer mogu povećati broj lažno pozitivnih i lažno negativnih nalaza što će otežati identifikaciju kandidatskih gena. Naravno, moguće je smanjiti strogost pragova u prisustvu heterogenosti i etničke pripadnosti; međutim to će smanjiti i moć detekcije varijanti. Korištenje pristupa koji prvo stavlja genotip za identifikaciju kandidatskih gena također bi moglo ponuditi rješenje za prevazilaženje ovih ograničenja.

Za razliku od analize uobičajenih varijanti, analiza rijetkih varijanti u studijama sekvenciranja cijelog egzoma procjenjuje skupove varijanti, a ne pojedinačne varijante.Funkcionalno označavanje predviđaju učinak ili funkciju rijetkih varijanti i pomažu u određivanju prioriteta rijetkih funkcionalnih varijanti. Uključivanje ovih anotacija može efikasno povećati snagu genetičke asocijacije analize rijetkih varijanti studija sekvenciranja cijelog genoma. Razvijeni su neki metodi i alati za provođenje funkcionalno informirane analize asocijacije rijetkih varijanti, uključivanjem funkcionalnih anotacija kako bi se osnažila analiza u studijama sekvenciranja cijelog egzoma.

Etičke implikacije