ORT

Protein O-GlcNAc transferaza, znana i kao OGT ili O-vezana N-acetilglukozaminiltransferaza je enzim (EC: 2.4.1.255) koji je kod ljudi kodiran genom OGT sa hromosoma X. OGT katalizira posttranslacijsko dodavanje O-GlcNAc u proteine.

Nomenklatura

Ostali nazivi uključuju: O-GlcNAc transferaza OGTaza O-vezana N-acetilglukozaminiltransferaza Uridin difosfo-N-acetilglukozamin:polipeptid β-N-acetilglukozaminiltransferaza

Sistematski naziv: UDP-N-α-acetil--glukozamin:[protein]-3-O-N-acetil-β--glukozaminil transferaza

Glikoziltransferaza OGT katalizira dodavanje jednog N-acetilglukozamina preko O-glikozidne veze na serin ili treonin i S-glikozidne veze sa cisteinskim ostacima nukleocitoplazmatskih proteina. Budući da se i fosforilacija i O-GlcNAcilacija natječu za slične ostatke serina ili treonina, ova dva procesa mogu se nadmetati za mjesta ili mogu promijeniti supstratnu specifičnost obližnjih mjesta sternim ili elektrostatskim efektima. Za ovaj gen su pronađene dvije varijante transkripta koje kodiraju citoplazmatske i mitohondrijske izoforme. OGT glikozilira mnoge proteine uključujući: histon H2B, AKT1, PFKL, KMT2E/MLL5, MAPT/TAU, faktor ćelije domaćina C1, i SIN3A.

O-GlcNAc transferaza je dio niza bioloških funkcija u ljudskom tijelu. OGT je uključen u rezistenciju na insulin u mišićnim ćelijama i adipocit ima, tako što inhibira fosforilaciju treonina 308 AKT1, povećavajući stopu fosforilacija IRS1 (kod serina 307 i serina 632/635), smanjujući insulinsku signalizaciju i glikozilirajuće komponente insulinskih signala. Dodatno, O-GlcNAc transferaza katalizira unutarćelijsku glikozilaciju ostataka serina i treonina uz dodatak N-acetilglukozamina. Studije pokazuju da su OGT aleli vitalni za embriogenezu, te da je OGT neophodan za unutarćelijsku glikozilaciju i vitalnost embrionskih matičnih ćelija. O-GlcNAc transferaza također katalizira posttranslacijsku modifikaciju koja modificira faktore transkripcije i RNK-polimerazu II; međutim specifična funkcija ove modifikacije je uglavnom nepoznata.

Proteaza OGT cijepa faktor ćelije domaćina C1, u jednoj ili više od 6 ponavljajućih sekvenci od 26 aminokiselina. TPR domen OGT veže se za karboksilni terminalni dio HCF1 proteolitskog ponavljanja tako da je regija cijepanja na aktivnom mjestu glikoziltransferaze iznad uridin-difosfat-GlcNAc Neophodan je veliki dio OGT kompleksa sa HCF1 za cijepanje HCF1, a HCFC1 je potreban za stabilizaciju OGT u jedru. HCF1 reguliše stabilnost OGT, koristeći posttranskripcijski mehanizam, međutim mehanizam interakcije sa HCFC1 je još uvijek nepoznat.

Aminokiselinska sekvenca Dužina polipeptidnog lanca je 1.046 aminokiselina, a molekulska težina 116.925 Da.

1020304050 MASSVGNVADSTEPTKRMLSFQGLAELAHREYQAGDFEAAERHCMQLWRQ EPDNTGVLLLLSSIHFQCRRLDRSAHFSTLAIKQNPLLAEAYSNLGNVYK ERGQLQEAIEHYRHALRLKPDFIDGYINLAAALVAAGDMEGAVQAYVSAL QYNPDLYCVRSDLGNLLKALGRLEEAKACYLKAIETQPNFAVAWSNLGCV FNAQGEIWLAIHHFEKAVTLDPNFLDAYINLGNVLKEARIFDRAVAAYLR ALSLSPNHAVVHGNLACVYYEQGLIDLAIDTYRRAIELQPHFPDAYCNLA NALKEKGSVAEAEDCYNTALRLCPTHADSLNNLANIKREQGNIEEAVRLY RKALEVFPEFAAAHSNLASVLQQQGKLQEALMHYKEAIRISPTFADAYSN MGNTLKEMQDVQGALQCYTRAIQINPAFADAHSNLASIHKDSGNIPEAIA SYRTALKLKPDFPDAYCNLAHCLQIVCDWTDYDERMKKLVSIVADQLEKN RLPSVHPHHSMLYPLSHGFRKAIAERHGNLCLDKINVLHKPPYEHPKDLK LSDGRLRVGYVSSDFGNHPTSHLMQSIPGMHNPDKFEVFCYALSPDDGTN FRVKVMAEANHFIDLSQIPCNGKAADRIHQDGIHILVNMNGYTKGARNEL FALRPAPIQAMWLGYPGTSGALFMDYIITDQETSPAEVAEQYSEKLAYMP HTFFIGDHANMFPHLKKKAVIDFKSNGHIYDNRIVLNGIDLKAFLDSLPD VKIVKMKCPDGGDNADSSNTALNMPVIPMNTIAEAVIEMINRGQIQITIN GFSISNGLATTQINNKAATGEEVPRTIIVTTRSQYGLPEDAIVYCNFNQL YKIDPSTLQMWANILKRVPNSVLWLLRFPAVGEPNIQQYAQNMGLPQNRI IFSPVAPKEEHVRRGQLADVCLDTPLCNGHTTGMDVLWAGTPMVTMPGET LASRVAASQLTCLGCLELIAKNRQEYEDIAVKLGTDLEYLKKVRGKVWKQ RISSPLFNTKQYTMELERLYLQMWEHYAAGNKPDHMIKPVEVTESA

Struktura

Ljudski OGT gen ima 1046 aminokiselinskih ostataka i heterotrimer je koji se sastoji od dvije podjedinice i jedne podjedinice od 78 kDa. Podjedinica od 110 kDa sadrži 13 tetratricopeptidna ponavljanja (TPR); 13. ponavljanje je skraćeno. Ove podjedinice su dimerizovane TPR ponavljanjima 6 i 7. OGT je visoko eksprimiran u pankreasu, a također je izražen u srcu, mozgu, skeletnim mišićima i posteljici. Pronađene su količine u tragovima u plućima i jetri. Mjesta vezivanja su određena za podjedinicu od 110 kDa. Ima 3 mjesta vezivanja na aminokiselinskim ostacima 849, 852 i 935. Vjerovatno aktivno mjesto je na ostatku 508.

Kristalna struktura O-GlcNAc transferaze nije dobro proučena, ali struktura binarnog kompleksa sa UDP i ternarnog kompleksa sa UDP i peptidnim supstratom je eksprimiran. OGT-UDP kompleks sadrži tri domena u svom katalitsčkom regionu: amino N-kraj|(N)- terminalni domen, karboksi (C)-terminalni domen i intervencioni domen (Int-D). Katalitska regija je povezana sa TPR ponavljanjima translacijskom spiralom (H3), koja se kreće od C-cat domena do N-cat domena, duž gornje površine katalitske regije. OGT-UDP-peptidni kompleks ima veći prostor između TPR domena i katalitske regije OGT-UDP kompleksa. CKII peptid, koji sadrži tri serinska ostatka i jedan treoninski ostatak, vezuje se u ovom prostoru. U 2021., analiza CryoEM od 5Å otkrila je odnos između katalitskih domena i netaknuti TPR regioni koji potvrđuju raspored dimera koji je prvi put viđen u samoj TPR strukturi X-zraka. Ova struktura podržava uređeni sekvencni bi-bi mehanizam koji se poklapa s činjenicom da je „pri zasićenim koncentracijama peptida, konkurentska inhibicija uzoraka dobijenih za UDP u odnosu na UDP-GlcNAc.”

Funkcija

Glikoziltransferaza OGT katalizira dodavanje jednog N-acetilglukozamina preko O-glikozidne veze na serin ili treonin i S-glikozidne veze sa cisteinskim ostacima nukleocitoplazmatskih proteina. Budući da se i fosforilacija i O-GlcNAcilacija natječu za slične ostatke serina ili treonina, ova dva procesa mogu se nadmetati za mjesta ili mogu promijeniti supstratnu specifičnost obližnjih mjesta sternim ili elektrostatskim efektima. Za ovaj gen su pronađene dvije varijante transkripta koje kodiraju citoplazmatske i mitohondrijske izoforme. OGT glikozilira mnoge proteine uključujući: histon H2B, AKT1, PFKL, KMT2E/MLL5, MAPT/TAU, faktor ćelije domaćina C1, i SIN3A.

O-GlcNAc transferaza je dio niza bioloških funkcija u ljudskom tijelu. OGT je uključen u rezistenciju na insulin u mišićnim ćelijama i adipocit ima, tako što inhibira fosforilaciju treonina 308 AKT1, povećavajući stopu fosforilacija IRS1 (kod serina 307 i serina 632/635), smanjujući insulinsku signalizaciju i glikozilirajuće komponente insulinskih signala. Dodatno, O-GlcNAc transferaza katalizira unutarćelijsku glikozilaciju ostataka serina i treonina uz dodatak N-acetilglukozamina. Studije pokazuju da su OGT aleli vitalni za embriogenezu, te da je OGT neophodan za unutarćelijsku glikozilaciju i vitalnost embrionskih matičnih ćelija. O-GlcNAc transferaza također katalizira posttranslacijsku modifikaciju koja modificira faktore transkripcije i RNK-polimerazu II; međutim specifična funkcija ove modifikacije je uglavnom nepoznata.

Proteaza OGT cijepa faktor ćelije domaćina C1, u jednoj ili više od 6 ponavljajućih sekvenci od 26 aminokiselina. TPR domen OGT veže se za karboksilni terminalni dio HCF1 proteolitskog ponavljanja tako da je regija cijepanja na aktivnom mjestu glikoziltransferaze iznad uridin-difosfat-GlcNAc Neophodan je veliki dio OGT kompleksa sa HCF1 za cijepanje HCF1, a HCFC1 je potreban za stabilizaciju OGT u jedru. HCF1 reguliše stabilnost OGT, koristeći posttranskripcijski mehanizam, međutim mehanizam interakcije sa HCFC1 je još uvijek nepoznat.

Mehanizam katalize

Molekulski mehanizam "O"-vezane "N"-acetilglukozamin transferaze također nije opširno proučavan, jer ne postoji potvrđena kristalna struktura enzima. Mehanizam koji su predložili Lazarus et al. je podržan obrascima inhibicije proizvoda UDP-a u uslovima zasićenja peptida. Ovaj mehanizam se odvija sa polaznim materijalima uridin-difosfat N-acetilglukozaminam i peptidni lancima sa reaktivnom serinskom ili treoninskom hidroksil grupom. Predložena reakcija je uređeni sekvencni bi-bi mehanizam. thumb|left|upright=3.0| Slika 2: Predloženi katalitski mehanizam O-GlcNAc transferaze. Uređen je sekvencni bi-bi mehanizam sa samo jednim korakom, ne uključujući prijenos protona. Peptid je predstavljen serinskim ostatkom sa reaktivnom hidroksilnom grupom.

Hemijska reakcija se može zapisati kao: UDP-N-acetil-D-glukozamin + [protein]-L-treonin → UDP + [protein]-3-O -(N-acetil-D-glukozaminil)-L-treonin

Prvo, hidroksilnu grupu serina deprotonira histidin 498, katalitska baza u ovoj predloženoj reakciji. Lizin 842 je također prisutan da stabilizuje UDP oblast. Kisikov ion tada napada šećer-fosfatnu vezu između glukozamina i UDP-a. Ovo rezultira cijepanjem UDP-N-acetilglukozamina na N-acetilglukozamin – peptid i UDP. Protonski transferi odvijaju se na fosfatu i histidinu 498. Ovaj mehanizam je podstaknut OGT genom koji sadrži O-vezanu N-acetilglukozamin transferazu. Osim prijenosa protona, reakcija se odvija u jednom koraku, kao što je prikazano na slici 2. Slika 2 koristi usamljeni ostatak serina kao predstavnika peptida sa reaktivnom hidroksilnom grupom. Treonin je također mogao biti korišten u mehanizmu.

Inhibitori Prijavljeni su mnogi inhibitori enzimske aktivnosti OGT. Inhibicija OGT dovodi do globalne regulacije O-GlcNAc. Čini se da ćelije pojačavaju OGT i reduciraju OGA kao odgovor na inhibiciju OGT.

5S-GlcNAc Ac45S-GlcNAc se unutarćelijsk pretvara u UDP-5S-GlcNAc, analogni inhibitor supstrata OGT-a. UDP-5S-GlcNAc se ne koristi efikasno kao donatorski šećer od strane OGT-a, vjerovatno zbog izobličenja piranoznog prstena, zamjenom kisika sumporom. Kao što se koriste druge glikoziltransferaze UDP-GlcNAc kao donatorski šećer, UDP-5S-GlcNAc ima neke nespecifične efekte na glikozilaciju na površini ćelije.

OSMI OSMI-1 je prvi put identificiran iz visokopropusnog skrininga, korištenjem fluorescentne polarizacije. Dalja optimizacija dovela je do razvoja OSMI-2, OSMI-3 i OSMI-4, koji vezuju OGT sa niskim nanomolarnim afinitetom. Rentgenska kristalografija je pokazala da kinolinon-6-sulfonamidni okvir spoja OSMI djeluje kao uridinov mimetik. OSMI-2, OSMI-3 i OSMI-4 imaju negativno nabijene karboksilatne grupe; esterifikacija čini ove inhibitore propusnim za ćelije.

Regulacija

thumb| Slika 3: Dinamička konkurencija između glikozilacije i fosforilacije proteina. O: Konkurencija između OGT i kinaze za serinsku ili treoninsku funkcionalnu grupu proteina. B: Zauzetost susjednog mjesta gdje se O-GlcNAc i O-fosfataza javljaju jedno pored drugog i mogu recipročno uticati na promet ili funkciju proteina. G krug predstavlja N-acetilglukozaminsku grupu, a P krug fosfatnu grupu. Slika prilagođena iz Harta.

O-GlcNAc transferaza je dio dinamičke konkurencije za serinsku ili treoninsku hidroksilnu funkcionalnu grupu u peptidnoj jedinici. Slika 3 prikazuje primjer recipročne zauzetosti istog i susjednog mjesta. Za zauzetost istog mjesta, OGT se takmiči sa kinazom da katalizira glikozilaciju proteina umjesto fosforilacije. Primjer zauzetosti susjednog mjesta pokazuje da se goli protein kataliziran OGT pretvara u glikoprotein, koji može povećati promet proteina kao što je tumorski represor p53.

Posttranslacijska modifikacija proteina pomoću O-GlcNAc je podstaknuta protokom glukoze kroz biosintetski put heksozamina. OGT katalizira vezivanje O-GlcNAc grupe za serin i treonin, dok O-GlcNAcase podstiče uklanjanje šećera. Ova regulacija je važna za višestruke ćelijske procese uključujući transkripciju, transdukciju signala i proteasomsku degradaciju. Također, postoji kompetitivna regulacija između OGT i kinaze da se protein veže na fosfatnu grupu ili O-GlcNAc, koji može promijeniti funkciju proteina u tijelu kroz nizvodne efekte.