500px|center||thumb|Razni tipovi lipid-vezanih oligosaharida (LLO), prekursorskih proizvoda u kod raznih organiama
N- vezana glikozilacija – u biohemiji – je vezivanje oligosaharida, ugljikohidrata koji se sastoji od nekoliko molekula šećera, ponekad zvanih i glikani, na atom dušika (amidni dušik asparaginskog (Asn) ostatatka proteina), u procesu koji se naziva N- glikozilacija. Ovaj tip veze je važna i za strukturu i za funkciju mnogih eukariotskih proteina. Proces glikozilacija povezanih sa „N“ javlja se kod eukariota i široko u arheja, ali vrlo rijetko kod bakterija. Priroda N-vezanih glikana za glikoprotein određena je proteinom i ćelijom u kojoj je eksprimiran. Također varira u zavisnosti od vrsta. Različite vrste sintetiziraju različite tipove "N"-vezanog glikana.
Energetika stvaranja veze U glikoproteinima postoje dva tipa veza: veze između saharidnih ostataka u glikanu i veze između glikanskog lanca i proteinske molekule.
U glikanskom lancu, šećerni dijelovi su međusobno povezani putem glikozidnih veza. Ove veze se obično formiraju između ugljika 1 i 4 molekule šećera. Formiranje glikozidne veze je energetski nepovoljno, pa je reakcija povezana sa hidrolizom dvije molekule adenozin-trifosfata (ATP).
S druge strane, vezivanje ostatka glikana za protein zahtijeva prepoznavanje konsenzus sekvence. N-vezani glikani gotovo su uvijek vezani za dušikov atom bočnog lanca asparagina (Asn) koji je prisutan kao dio Asn–X–Ser /Thr konsenzusne sekvence, gdje je X bilo koja aminokiselina osim prolina (Pro).
U životinjskim ćelijama, glikan vezan za asparagin je gotovo neizbježno N-acetilglukozamin (GlcNAc) u β-konfiguraciji. Ova β-veza slična je glikozidnoj vezi između ostataka šećera u glikanskoj strukturi, kako je gore opisano. Umjesto da se veže za šećernu hidroksil grupu, anomerni ugljikov atom je vezan za amidni dušik. Energija potrebna za ovu vezu dolazi iz hidrolize molekula pirofosfata.
Biosinteza upright=2|thumb| Put biosinteze N–vezanih glikoproteina: Sinteza N – vezanog glikana počinje u endoplazmatskom retikulumu, nastavlja se u Golgijevom aparatu i završava na plazmamembrani, gdje se nalaze N– vezani glikoproteini ili se izlučuju ili se ugrađuju u plazmamembranu. Biosinteza N- vezanih glikana odvija se u tri glavna koraka: Sinteza dolihol-vezanog prekursora oligosaharida En blokira prijenos prekursora oligosaharida u protein Prerada oligosaharida
Sinteza, en blok prijenos i početno obrezivanje prekursornog oligosaharida događa se u endoplazmatskom retikulumu (ER). Naknadna obrada i modifikacija oligosaharidnog lanca odvijaju se u Golgijevom aparatu.
Sinteza glikoproteina je stoga prostorno odvojena u različitim ćelijskim odjeljcima. Stoga, tip sintetiziranog "N"-glikana ovisi o njegovoj dostupnosti različitim enzimima prisutnim u tim ćelijskim organelama.
Međutim, unatoč raznolikosti, svi N-glikani se sintetiziraju putem zajedničkog puta sa zajedničkim jezgrom glikanske strukture. Jezgro glikanske strukture se u osnovi sastoji od dva N- acetil glukozamina i tri manozna ostatka. Ovaj jezgarni glikan se zatim dodatno razrađuje i modificira, što rezultira raznolikim rasponom N-glikanskih struktura.
Sinteza prekursorskog oligosaharida Proces N-vezane glikozilacije počinje stvaranjem dolihol-vezanog GlcNAc šećera. Dolihol je lipidna molekula od ponavljajućih izoprenskih jedinica. Nalazi se vezan za membranu ER. Molekule šećera su vezani za dolihol putem pirofosfatne veze (jedan fosfat je prvobitno bio povezan s doliholom, a drugi fosfat je došao iz šećernog nukleotida). Lanac oligosaharida se zatim produžava dodavanjem različitih molekula šećera u postupnim vezanjima, kako bi nastao prekursor oligosaharida.
Sastavljanje ovog prekursorskog oligosaharida odvija se u dvije faze: I i II. Faza I se odvija na citoplazmatskoj strani ER, a faza II se na lumenskoj strani ER.
Molekula prekursora, spremna za prijenos u protein, sastoji se od dvije molekule GlcNAc, devet manoza i tri glukoze.
Faza I Koraci Lokacija
Dva UDP-GlcNAc ostatka vezana su za molekulu dolihola ugrađena u membranu ER. Šećer i dolihol tvore pirofosfatnu vezu. Pet GDP-Man ostataka je vezano za GlcNAc disaharid. Ove korake izvodi glikoziltransferaza. Proizvod: Dolichol-GlcNAc 2–Man 5|| Citoplazmatska strana ER U ovoj tački, lipidno povezani glikan je translociran preko membrane što ga čini dostupnim enzimima u lumenu endoplazmatskog retikuluma. Ovaj proces translokacije još uvijek je slabo shvaćen, ali se predlaže da ga izvodi enzim poznat kao flipaza. Faza II * Rastući glikan je izložen na lumenskoj strani membrane ER i dodaju se sljedeći šećeri (4 manoze i 3 glukoze). Dol-P-Man je donor ostataka manoze (formacija: Dol-P + GDP-Man → Dol-P-Man + GDP), a Dol-P-Gluc je donor ostatka glukoze (formacija: Dol-P + UDP-Glc → Dol-P-Glc + UDP). Ovi dodatni šećeri transportuju se u lumen iz citoplazme ER-a, preko vezivanja za molekulu dolihola i naknadnom translokacijom u lumen, uz pomoć enzima flipaza. (Za translokaciju više šećera odjednom koriste se različiti dolikoli u membrani). Proizvod: Dolichol - GlcNAc2–Man9-Glc3|| Lumenska strana ER
Funkcija N-vezani glikani imaju unutrašnje i vanjske funkcije.
Unutar imunskog sistema, N-vezani glikani na površini imunske ćelije pomažu diktirati taj obrazac ćelijske migracije, npr. imunske ćelije koje migriraju na kožu imaju specifične glikozilacije koje pogoduju prelasku na to mjesto. Obrasci glikozilacije na različitim imunoglobulinima, uključujući IgE, IgM, IgD, IgA i IgG, daju im jedinstvene efektorske funkcije promjenom njihovog afiniteta za Fc i druge imunske receptore. Glikani mogu biti uključeni i u diskriminaciju "sebe" i "ne sebe", što može biti relevantno za patofiziološke poremećaje različitih autoimunskih bolesti.
+Funkcije N-vezanih glikana Unutrašnji Obezbjeđivanje strukturnih komponenti ćelijskog zida i vanćelijskog matriksa. Promijene svojstava proteina, kao što su stabilnost i topljivost (stabilniji na visoku temperaturu, pH itd.). Vanjski Usmjeravanje prometa glikoproteina. Posredovanje ćelijske signalizacije (interakcija ćelija – ćelija i ćelija – matriks).
U nekim slučajevima interakcija između N-glikana i proteina stabilizira protein putem složenih elektronskihe efekata.
Klinički značaj Promjene u N- vezanoj glikozilaciji povezane su s različitim bolestima, uključujući reumatoidni artritis, dijabetes tipa 1, Crohnobvu bolest, i karcinome.
Mutacije u 18 gena uključenih u N-vezanu glikozilaciju rezultiraju raznim bolestima, od kojih svećina odnosi na nervni sistem.
Značaj u terapijskim proteinima
Mnogi terapijski proteini na tržištu su antitijela, koja su N-vezani glikoproteini. Naprimjer, Etanercept, Infliximab i Rituximab su N-glikozilirani terapijski proteini.
thumb|280px| Razlika između glikana koji proizvode ljudskih i životinjskih ćelija. Ljudskim ćelijama nedostaje Neu5Gc kapa.
Važnost N-vezane glikozilacije postaje sve evidentnija na području lijekova. Iako bakterijski ili kvasni sistemi u proizvodnji proteina imaju značajne potencijalne prednosti, npr. visok prinos i niska cijena, problemi nastaju kada je protein od interesa glikoprotein. Većina prokariotskih ekspresijskih sistema, poput E. coli ne može izvesti posttranslacijske modifikacije. S druge strane, eukariotski ekspresijski domaćini, kao što su kvasci i životinjske ćelije, imaju različite obrasce glikozilacije. Proteini proizvedeni u ovim ekspresijskim domaćinima često nisu identični ljudskim proteinima i stoga uzrokuju imunogene reakcije kod pacijenata. Naprimjer, S. cerevisiae (kvasac) često proizvodi imunogene glikane s visokom razinom manoze.
Sistemi ekspresije sisara koji nisu ljudski, poput CHO ili ćelija NS0 imaju potrebne mehanizme za dodavanje složenih glikana ljudskog tipa. Međutim, glikani proizvedeni u ovim sistemima mogu se razlikovati od glikana proizvedenih u ljudi, jer se mogu zatvoriti N-glikolilneuraminskom (Neu5Gc) i N- acetilneuraminskom kiselinom (Neu5Ac), dok ljudske ćelije proizvode samo glikoproteine koji sadrže N-acetilneuraminsku kiselinu. Nadalje, životinjske ćelije također mogu proizvoditi glikoproteine koji sadrže epitop galaktoza-alfa-1,3-galaktoza, koji može izazvati ozbiljne alergijske reakcije, uključujući anafilaksijski šok, kod ljudi koji imaju alergiju alfa-gal.
Ovi nedostaci riješeni su s nekoliko pristupa, poput uklanjanja puteva koji stvaraju te glikanske strukture genetičkim nedostacima. Nadalje, drugi ekspresijski sistemi genetički su projektirani za proizvodnju terapijsih glikoproteina "N"-vezanim glikanima kooji su slični ljudskim. Tu spadaju kvasci poput Pichia pastoris, ćelijske linije insekata, zelene biljke, pa čak i bakterije.
Također pogledajte Glikozilacija Ekspresija gena N- Glikoziltransferaza
Reference
Vanjski linkovi GlycoEP: In silico Platform for Prediction of N-, O- and C-Glycosites in Eukaryotic Protein Sequences
Kategorija:Organska hemija Kategorija:Biohemija