Neurofibromin 1 (NF1) je ljudski gen na hromosomu 17.
NF1 kodira neurofibromin, GTPaza-aktivirajući protein koji negativno regulira aktivnost RAS/MAPK puta, ubrzavajući hidrolizu Ras-vezanog GTP-a.
Gen NF1 kodira neurofibromin, citoplazmatski protein koji se pretežno eksprimira u neuronima, Schwannovim ćelijama, oligodendrocitima i leukocitima. To je multidomenska molekula koja ima sposobnost regulacije nekoliko unutarćelijskih procesa, uključujući put RAS-cAMP, ERK/MAP i kinaznu kaskadu, adenilil-ciklazu i citoskeletni sklop.
Aminokiselinska sekvenca Dužina polipeptidnog lanca je 2.839 aminokiselina, a molekulska težina 319.372 Da..
1020304050 MAAHRPVEWVQAVVSRFDEQLPIKTGQQNTHTKVSTEHNKECLINISKYK FSLVISGLTTILKNVNNMRIFGEAAEKNLYLSQLIILDTLEKCLAGQPKD TMRLDETMLVKQLLPEICHFLHTCREGNQHAAELRNSASGVLFSLSCNNF NAVFSRISTRLQELTVCSEDNVDVHDIELLQYINVDCAKLKRLLKETAFK FKALKKVAQLAVINSLEKAFWNWVENYPDEFTKLYQIPQTDMAECAEKLF DLVDGFAESTKRKAAVWPLQIILLILCPEIIQDISKDVVDENNMNKKLFL DSLRKALAGHGGSRQLTESAAIACVKLCKASTYINWEDNSVIFLLVQSMV VDLKNLLFNPSKPFSRGSQPADVDLMIDCLVSCFRISPHNNQHFKICLAQ NSPSTFHYVLVNSLHRIITNSALDWWPKIDAVYCHSVELRNMFGETLHKA VQGCGAHPAIRMAPSLTFKEKVTSLKFKEKPTDLETRSYKYLLLSMVKLI HADPKLLLCNPRKQGPETQGSTAELITGLVQLVPQSHMPEIAQEAMEALL VLHQLDSIDLWNPDAPVETFWEISSQMLFYICKKLTSHQMLSSTEILKWL REILICRNKFLLKNKQADRSSCHFLLFYGVGCDIPSSGNTSQMSMDHEEL LRTPGASLRKGKGNSSMDSAAGCSGTPPICRQAQTKLEVALYMFLWNPDT EAVLVAMSCFRHLCEEADIRCGVDEVSVHNLLPNYNTFMEFASVSNMMST GRAALQKRVMALLRRIEHPTAGNTEAWEDTHAKWEQATKLILNYPKAKME DGQAAESLHKTIVKRRMSHVSGGGSIDLSDTDSLQEWINMTGFLCALGGV CLQQRSNSGLATYSPPMGPVSERKGSMISVMSSEGNADTPVSKFMDRLLS LMVCNHEKVGLQIRTNVKDLVGLELSPALYPMLFNKLKNTISKFFDSQGQ VLLTDTNTQFVEQTIAIMKNLLDNHTEGSSEHLGQASIETMMLNLVRYVR VLGNMVHAIQIKTKLCQLVEVMMARRDDLSFCQEMKFRNKMVEYLTDWVM GTSNQAADDDVKCLTRDLDQASMEAVVSLLAGLPLQPEEGDGVELMEAKS QLFLKYFTLFMNLLNDCSEVEDESAQTGGRKRGMSRRLASLRHCTVLAMS NLLNANVDSGLMHSIGLGYHKDLQTRATFMEVLTKILQQGTEFDTLAETV LADRFERLVELVTMMGDQGELPIAMALANVVPCSQWDELARVLVTLFDSR HLLYQLLWNMFSKEVELADSMQTLFRGNSLASKIMTFCFKVYGATYLQKL LDPLLRIVITSSDWQHVSFEVDPTRLEPSESLEENQRNLLQMTEKFFHAI ISSSSEFPPQLRSVCHCLYQATCHSLLNKATVKEKKENKKSVVSQRFPQN SIGAVGSAMFLRFINPAIVSPYEAGILDKKPPPRIERGLKLMSKILQSIA NHVLFTKEEHMRPFNDFVKSNFDAARRFFLDIASDCPTSDAVNHSLSFIS DGNVLALHRLLWNNQEKIGQYLSSNRDHKAVGRRPFDKMATLLAYLGPPE HKPVADTHWSSLNLTSSKFEEFMTRHQVHEKEEFKALKTLSIFYQAGTSK AGNPIFYYVARRFKTGQINGDLLIYHVLLTLKPYYAKPYEIVVDLTHTGP SNRFKTDFLSKWFVVFPGFAYDNVSAVYIYNCNSWVREYTKYHERLLTGL KGSKRLVFIDCPGKLAEHIEHEQQKLPAATLALEEDLKVFHNALKLAHKD TKVSIKVGSTAVQVTSAERTKVLGQSVFLNDIYYASEIEEICLVDENQFT LTIANQGTPLTFMHQECEAIVQSIIHIRTRWELSQPDSIPQHTKIRPKDV PGTLLNIALLNLGSSDPSLRSAAYNLLCALTCTFNLKIEGQLLETSGLCI PANNTLFIVSISKTLAANEPHLTLEFLEECISGFSKSSIELKHLCLEYMT PWLSNLVRFCKHNDDAKRQRVTAILDKLITMTINEKQMYPSIQAKIWGSL GQITDLLDVVLDSFIKTSATGGLGSIKAEVMADTAVALASGNVKLVSSKV IGRMCKIIDKTCLSPTPTLEQHLMWDDIAILARYMLMLSFNNSLDVAAHL PYLFHVVTFLVATGPLSLRASTHGLVINIIHSLCTCSQLHFSEETKQVLR LSLTEFSLPKFYLLFGISKVKSAAVIAFRSSYRDRSFSPGSYERETFALT SLETVTEALLEIMEACMRDIPTCKWLDQWTELAQRFAFQYNPSLQPRALV VFGCISKRVSHGQIKQIIRILSKALESCLKGPDTYNSQVLIEATVIALTK LQPLLNKDSPLHKALFWVAVAVLQLDEVNLYSAGTALLEQNLHTLDSLRI FNDKSPEEVFMAIRNPLEWHCKQMDHFVGLNFNSNFNFALVGHLLKGYRH PSPAIVARTVRILHTLLTLVNKHRNCDKFEVNTQSVAYLAALLTVSEEVR SRCSLKHRKSLLLTDISMENVPMDTYPIHHGDPSYRTLKETQPWSSPKGS EGYLAATYPTVGQTSPRARKSMSLDMGQPSQANTKKLLGTRKSFDHLISD TKAPKRQEMESGITTPPKMRRVAETDYEMETQRISSSQQHPHLRKVSVSE SNVLLDEEVLTDPKIQALLLTVLATLVKYTTDEFDQRILYEYLAEASVVF PKVFPVVHNLLDSKINTLLSLCQDPNLLNPIHGIVQSVVYHEESPPQYQT SYLQSFGFNGLWRFAGPFSKQTQIPDYAELIVKFLDALIDTYLPGIDEET SEESLLTPTSPYPPALQSQLSITANLNLSNSMTSLATSQHSPGIDKENVE LSPTTGHCNSGRTRHGSASQVQKQRSAGSFKRNSIKKIV
Simboli
C: Cistein D: Asparaginska kiselina E: Glutaminska kiselina F: Fenilalanin G: Glicin H: Histidin I: Izoleucin K: Lizin L: Leucin M: Metionin N: Asparagin P: Prolin Q: Glutamin R: Arginin S: Serin T: Treonin V: Valin W: Triptofan Y: Tirozin
Kloniranje i ekspresija Buchberg et al. (1990) sekvencirali su dio mišjeg gena za NF1 i pokazali da je predviđena aminokiselinska sekvenca gotovo ista kao i odgovarajuća regija proizvoda ljudfskog gena NF1. Kompjuterskim pretragama utvrđena je homologija između gena NF1 miša i gena Ira1 i Ira2 identifikovanih u Saccharomyces cerevisiae, koji negativno reguliraju RAS-ciklični AMP put. RAS proteini su uključeni u kontrolu proliferacije i diferencijacije u ćelijama sisara. Njihova aktivnost modulira se njihovom sposobnošću vezanja i hidrolize guaninskih nukleotida. GTP-vezanje aktivira RAS, dok se hidrolizom GTP deaktivira RAS. Mutirani oblici RAS pronađeni u ljudskim tumorima znatno su smanjili aktivnost GTPaza, što je rezultiralo akumulacijom RAS u aktivnom obliku vezanom za GTP.
Xu et al. (1990) proširili su poznati otvoreni okvir čitanja ljudskog gena NF1 pretragom i sekvenciranjem cDNK. Nova sekvenca predvidjela je 2.485 aminokiselina NF1 peptida. Regija od 360 ostatka pokazala je značajnu sličnost sa katalitskim domenima i ljudskogog i goveđeg proteina koji aktivira GTPaze (GAP, ili RASA1; 139150). Sugeriraju da NF1 kodira citoplazmatski protein sličan GAP-u koji može biti uključen u kontrolu rasta ćelija, interakcijom s proteinima kao što je RAS-ov genski proizvod. Marchuk et al. (1991) izvijestili su o opsežnom oštećenju cDNK, što je rezultiralo kloniranjem kompletnog područja kodiranja NF1 transkripta. Analiza sekvenci otkrila je otvoreni okvir čitanja od 2.818 aminokiselina, iako alternativno prerađeni proizvodi mogu kodirati različite proteinske izoforme.
Da bi proučavali genski proizvod NF1, Gutmann et al. (1991) kreirali su antitijela i na fuzijske proteine i na sintetske peptide. I imunoprecipitacijom i imunoblotingom, identificiran je specifični protein od oko 250 kD. Protein je pronađen u svim ispitivanim tkivima i ćelijskim linijama, a otkriven je u tkivima ljudi, pacova i miša. Na osnovu homologije između produkta gena NF1 i članova superporodi ce GAP, predložen je naziv protein povezan s NF1-GAP (NF1-GRD). DeClue et al. (1991) uzgajali su kunićne antiserume na bakterijski sintetizirani peptid, koji odgovara domenu NF1, vezanom za GAP (NF1-GRD). Serumi su specifično otkrili protein od 280 kD u lizatima HeLa ćelija. Ovaj protein je odgovarao proizvodu gena NF1, kao što pokazuje nekoliko kriterija. NF1 je bio prisutan u kompleksu molekulske mase u ćelijskim linijama fibroblasta i SCSwannovim ćelijama i čini se da se povezuje sa vrlo velikim (400-500 kD) proteinima u obje ćelijske linije.
Daston et sl. (1992) podigli su antitijela protiv peptida kodiranih dijelovima NF1 cDNK. Ova antitijela su specifično prepoznala protein od 220 kD, nazvan neurofibromin, u kičmenoj moždini ljudi i pacova. Neurofibromina je najviše bilo u nervnom sistemu. Imunobojenje presjeka tkiva ukazalo je da neuroni, oligodendrociti i nemijelinizirajuće Schwannove ćelije sadrže neurofibromin, dok astrociti i mijelinizirajuće Schwannove ćelije ne sadrže.
Trovo-Marqui i Tajara (2006) izvijestili su da su čtiri prerađena egzona (9a, 10a-2, 23a i 48a) odgovorna za proizvodnju pet izoformi ljudskog neurofibromina (II, 3, 4, 9a i 10a-2), koji pokazuju različitu ekspresiju u različitim tkivima. Neurofibromin II, nazvan i GRD2 (GAP povezan sa domenom II), rezultat je umetanja egzona 23a, eksprimiran je u Schwannovim ćelijama i ima smanjeni kapacitet da djeluje kao GAP. Neurofibromini 3 i 4, koji sadrže egzon 48a, odnosno oba egzona 23a i 48a, eksprimiraju se u mišićnom tkivu, uglavnom u srčanim i skeletnim mišićima. Neurofibromin 9a (koji se naziva i 9br) rezultat je uključivanja egzona 9a i pokazuje ograničenu neuronsku ekspresiju. Izoforma 10a-2 rezultat je insercije egzona 10a-2, koji uvodi transmembranski domen. Ova izoforma je uočena u većini analiziranih ljudskih tkiva.
Struktura gena Xu et al. (1990) otkrili su da tri aktivna gena, zvana OMGP , EVI2B i EVI2A , leže unutar introna NF1, ali u suprotnoj orijentaciji. Pronašli su pseudogen gena AK3L1 u intronu gena NF1. Činilo se da je riječ o prerađenom pseudogenu, jer mu je nedostajalo introna i sadržavao je poliadenililatni trakt; ipak je zadržao potencijal kodiranja, jer otvoreni okvir čitanja nije narušen nijednom uočenom osnovnom zamjenom. Heim et al. (1994) citirali su dokaze da se gen NF1 proteže na približno 350 kb genomske DNK, kodira iRNK od 11 do 13 kb i sadrži najmanje 56 egzona.
Li et al. (1995) pokazali su da je 5-osnovni kraj gena NF1 ugrađen u CpG otok koji sadrži restrikcijsko mjesto NotI i da ostatak gena leži u susjednom fragmentu NotI od 35 kb. U svojim naporima da razviju sveobuhvatan prikaz za mutacije NF1, izolirali su genomske klonove DNK, koji zajedno sadrže čitavu sekvencu NF1 cDNK. Identificirali su sve granice introna i egzona područja kodiranja i ustanovili da ono sadrži najmanje 59 egzona. Otkriveno je da 3-primarno neprevedeno područje gena NF1 obuhvata približno 3,5 kb i da je kontinuirano sa stop kodonom. Trovo-Marqui i Tajara (2006) objavili su da gen NF1 sadrži 61 egzon.
Mapiranje Barker et al. (1987) pokazali su da se gen odgovoran za neurofibromatozu tipa I (NF1) nalazi u pericentromernom regionu hromosoma 17. Wallace et. (1990) identificirali su veliki transkript iz kandidirane NF1 regije na hromosomu 17q11.2, koji je poremećen kod tri pacijenta s neurofibromatozom tipa I. Promjene su poremetile ekspresiju NF1 transkripta kod sva tri pacijenta, u skladu s hipotezom da djeluje kao supresor tumora.
Pseudogeni Legius et al. (1992) okarakterizirali su lokus povezan s NF1 na hromosomu 15. Neprerađeni pseudogen NF1 (NF1P1) može stvoriti dodatne fragmente u Southern blottingu, pulsnom poljskom gelu i PCR eksperimentima s nekim NF1 sondama cDNK ili oligonukleotidima. Pored toga, određena područja gena NF1 ukrštaju se s lokusom na hromosomu 14. Ovi lokusi mogu prouzročiti zabunu u analizi mutacije pacijenata s NF1. U ljudskom genomu, identificirani su brojni pseudogeni NF1. Oni u 2q21, 14q11 i 22q11 čine podskup sa sličnom genomskom organizacijom i homologijom visoke sekvence. PCR-om i fluorescentnom hibridizacijom in situ, Luijten et al. (2001) proučavali su opseg homologije regija koje okružuju ove pseudogene NF1. Otkrili su da je fragment od najmanje 640 kb homologan između tri regije. Na osnovu prethodnih studija i ovih novih otkrića, predložili su model za širenje regija koje sadrže pseudogen NF1. Fragment od približno 640 kb prvo je dupliran u hromosomskom području 2q21 i transponiran u 14q11. Potom je ovaj fragment dupliran 14q11 i transponiran u 22q11. Dio fragmenta od 640 kb u 14q11, dužine od oko 430 kb, dalje je umnožen u različitoj mjeri u 14q11. Pored toga, identificirali su sekvence koje mogu olakšati dupliranje i transpoziciju fragmenata 640 kb i 430 kb.
Funkcija gena DeClue et al. (1992) iznijeli su dokaze koji impliciraju protein NF1 kao produkt genskog supresora koji negativno regulira p21 (ras) i definirali 'pozitivnu' ulogu rasta aktivnosti RAS-a u NF1 malignim tumorima. Basu et sl. (1992) iznijeli su dokaze koji potkrepljuju hipotezu da je NF1 tumor-supresorski gen, čiji proizvod djeluje uzvodno od proteina RAS. Pokazali su da su RAS proteini u ćelijskim linijama malignih tumora kod pacijenata sa NF1 u konstitutivno aktiviranom stanju, mjereno omjerom guaninskih nukleotida vezanim za njih, tj. omjerom GTP (aktivan) prema BDP (neaktivan). Transformacijski mutanti p21 (ras) vežu velike količine GTP-a, dok je divlji tip p21 (ras) gotovo u potpunosti vezan za BDP. Nakafuku et al. (1993) iskoristili su sistem kvašćevog RAS-a da izoliraju mutante u RAS GTPaza, aktivirajući domen povezanu s proteinima proizvoda NF1 gena (NF1-GRD) koji može djelovati kao antionkogeni specifični za onkogeni RAS. Pokazali su da su ti mutirani NF1-GRD, kada su eksprimirani u ćelijama sisara, sposobni da induciraju morfološku reverziju RAS transformisanih ćelija NIH 3T3.