W związku z szybkim wzrostem liczby mieszkańców Rostowa, starosta parafii Narodzenia Matki Bożej Konstantin Michajłow-Niefiodow oraz kupiec Siemion Koszkin zwrócili się do biskupa jekaterynosławskiego Innocentego, a za jego pośrednictwem do Świętego Synodu, z prośbą o zgodę na budowę nowego, znacznie obszerniejszego soboru, który sami zamierzali współfundować. Zgodę na budowę otrzymali w 1845, zaś prace nad wznoszeniem obiektu trwały od 1854 do 1860. Cerkiew usytuowano przy ulicy Staropocztowej (ob. Stanisławskiego), nieco na zachód od starszej cerkwi, którą następnie rozebrano, by zrobić miejsce na dzwonnicę soboru wzniesioną w latach 1875–1887 według projektu A. Kampioniego, z funduszy przekazanych przez kupca Piotra Maksimowa i innych darczyńców. W roku ukończenia prac budowlanych na dzwonnicy zawieszono dzwony odlane z fundacji I. Panczenki w fabryce Finlandskiego w Moskwie. Jeszcze przed tą datą na jednej z niższych kondygnacji dzwonnicy urządzono cerkiew-baptysterium pod wezwaniem św. Mikołaja.