Większość współczesnych systemów operacyjnych obsługuje złącze USB – dotyczy to między innymi systemów firmy Microsoft, zaczynając od Windows 95 w wersji OSR2 (istnieje także poprawka do wersji OSR1 udostępniająca obsługę USB), systemów Windows z rodziny NT (od wersji 5.0), systemów opartych na jądrze Linux, systemów BSD oraz Mac. W przypadku starszych było to możliwe przez sterowniki lub wbudowane w BIOS-ie karty – na przykład w Amidze (od 3.0 razem z MUI), DOS-ie (chociaż karta ISA obsługuje aktualnie tylko tryb pamięci masowej).
Praca w sieci Jedną z ważniejszych cech portu USB jest zgodność ze standardem Plug and Play. Architektura USB składa się z serwera (hosta), wielu portów USB oraz urządzeń do nich podłączonych. Host USB może zarządzać wieloma kontrolerami, a każdy kontroler może udostępniać jeden lub więcej portów USB. Urządzenia można z sobą łączyć, tworząc sieć o topologii drzewa, wykorzystując do tego koncentratory USB. Mogą być one połączone kaskadowo, tworząc nawet pięciopoziomową strukturę drzewiastą. W całej sieci można podłączyć do 127 urządzeń USB, jednak ze względu na pobór mocy ich liczbę trzeba ograniczyć. Każde urządzenie komunikuje się z kontrolerem przy wykorzystaniu kanałów logicznych, których może być do 32, przy czym 16 z nich jest wejściowych i 16 wyjściowych.