Dopiero później stałe osady pojawiły się w żyznych dolinach rzek: kultura Hassuna w Mezopotamii (początki VI tysiąclecia p.n.e.), zastąpiona później przez kulturę Samarra (ok. 5500 lat p.n.e.), a następnie Halaf (koniec VI tysiąclecia p.n.e.). Dwie ostatnie kultury przyczyniły się do ekspansji wiedzy metalurgicznej (opartej na wykorzystaniu miedzi), opanowanej w VI tysiącleciu p.n.e. na terenie Anatolii (początki chalkolitu).
Od V tysiąclecia p.n.e. na terenie południowej Mezopotamii rozwijała się kultura Ubajd – obejmująca większy obszar i bardziej zaawansowana niż wcześniejsze. Jej przedstawiciele prawdopodobnie założyli pierwsze osiedla w tym rejonie (takie jak Eridu, Ur, Uruk), które w późniejszym okresie rozrosły się w wielkie ośrodki miejskie, budowali monumentalne świątynie, a także rozwinęli na większą skalę system irygacyjny umożliwiający powiększenie areału upraw. W ostatnich fazach tej kultury (lub później – w drugiej połowie IV tysiąclecia p.n.e.) w Mezopotamii pojawili się Sumerowie (o ile nie byli ludnością autochtoniczną).
Mezopotamia thumb|upright|Gliniana tabliczka z pismem klinowym (ok. 2400 lat p.n.e.)