1 września 1571 r. Hernández wyruszył z Sewilli do Meksyku. Na Wyspach Kanaryjskich zatrzymał się na dłuższy postój, który poświęcił na zbadanie i opisanie roślinności archipelagu (niestety, rękopis ten nie zachował się). Następnie przez San Domingo i Hawanę dotarł w lutym 1572 r. do Veracruz, by 1 marca złożyć swe listy uwierzytelniające wicekrólowi Meksyku.
Po przybyciu do Ameryki Hernández przebył ciężką chorobę nerek, co opóźniło realizację programu jego badań. Podróżował w lektyce niesionej przez muły, w towarzystwie swego syna Juana, który zajmował się sprawami organizacyjnymi wyprawy. Ekspedycji towarzyszył geograf, liczni rysownicy oraz miejscowi indiańscy „medycy”, od których Hernández zdobywał wiedzę o leczniczych właściwościach meksykańskich roślin i uczył się miejscowego języka. Badania objęły tereny dzisiejszych stanów Michoácan, Colima, Querétaro, Oaxaca, a zwłaszcza Puebla i Guerrero. W marcu 1574 r. osiadł w Hospital Real w Meksyku, gdzie nie tylko leczył, ale i praktykował z miejscowymi roślinami leczniczymi. Opracowywał zebrane zbiory (m.in. ogromny zielnik) i spisywał swe obserwacje (38 zeszytów, z tego 3 w języku nahuatl).