Do 1582 r. zamknięto zbór kalwiński, a w 1625 r. został zamknięty na żądanie jezuitów zbór czesko-braterski na Miedzyniu Wielkim. Od 1627 r. obowiązywał zakaz sprowadzania innowierców do miasta, który wydał król Zygmunt III Waza. Odtąd wyznawcy protestantyzmu w Bydgoszczy stanowili margines życia religijnego, a ci którzy przetrwali – kult odprawiali w zborze w Łobżenicy, bądź prywatnie w domach. W okresie potopu szwedzkiego protestanccy mieszkańcy pomogli we wkroczeniu wojsk szwedzkich do miasta, co dodatkowo zraziło do nich katolików.
Począwszy od II połowy XVII wieku, oraz przez cały XVIII wiek postępowała kolonizacja okolic Bydgoszczy przez ludność niemiecką wyznania luterańskiego oraz Holendrów – mennonitów. Założono wtedy ok. 40 wsi na prawie „olęderskim” w otoczeniu miasta, które zasiedlone były mieszaną wyznaniowo ludnością. Jednakże ludność w murach miasta Bydgoszczy aż do końca okresu staropolskiego zachowała niemal jednorodny katolicki charakter wyznaniowy.