Drugi rejs bojowy 17 czerwca U-Boot wypłynął w swój drugi rejs bojowy z zadaniem wykonania operacji minowania na wodach amerykańskich (zobacz trasę). Podróż nie była szybka, ze względu na konieczność racjonalnego wykorzystywania paliwa. Podczas przejścia przez Kanał Starych Bahamów U-166 miał pierwsze kontakty z wrogimi jednostkami. 10 lipca zaatakował 6 torpedami konwój złożony z dwóch frachtowców oraz dwóch okrętów eskorty, jednak nie odnotowano trafienia. Następnego dnia zatopił z działa żaglowiec „Carmen” (84 BRT) płynący pod banderą Dominikany, na pozycji 19.43N 70.12W. Statek wiózł do Puerto Plata-Ponce 2000 worków z kukurydzą, a także mahoń oraz cedr. Z ośmiu osób załogi zginęła jedna.
13 lipca napotkał silnie chroniony konwój złożony z 11 statków. Tego samego dnia o 18:10 zatopił nieuzbrojony i niekonwojowany amerykański frachtowiec „Oneida” (2309 BRT) płynący pod balastem do portu Punta Gorda (na pozycji 20.17N 74.06W). Obserwatorzy na statku dostrzegli zbliżającą się torpedę, jednak było za późno na manewr wymijający. Frachtowiec zatonął w ciągu trzech minut i załoga nie miała czasu na spuszczenie łodzi ratunkowych, ratowała się więc na tratwach.