Praca w NASA Shepherd został zakwalifikowany do grona astronautów NASA w 1984. W 1986 jego przeszkolenie Navy SEALa okazało się przydatne dla NASA, która włączyła go do grupy prowadzącej operacje ratunkowe po katastrofie wahadłowca Challenger. Następnie jako specjalista misji uczestniczył w trzech wyprawach wahadłowców: STS-27 (1988), STS-41 (1990), podczas której m.in. umieszczono na orbicie sondę Ulysses, oraz STS-52 (1992).
W 1993 został przydzielony do kierownictwa programu budowy i rozwoju Międzynarodowej Stacji Kosmicznej (ISS). Od 31 października 2000 do 21 marca 2001 wraz z rosyjskimi kosmonautami – Jurijem Gidzenką i Siergiejem Krikalowem – tworzył pierwszą załogę (Ekspedycja 1) przebywającą na ISS. Pełnił funkcję dowódcy misji.
Shepherd spędził w kosmosie w sumie ponad 159 dni. Opuścił NASA w styczniu 2002, przechodząc do sektora prywatnego.
Odznaczenia i nagrody Congressional Space Medal of Honor (2003) National Intelligence Medal of Achievement NASA „Steve Thorne” Aviation Award Wprowadzenie do Panteonu Sławy Astronautów Stanów Zjednoczonych (United States Astronaut Hall of Fame) (2009) Medal „Za zasługi w podboju kosmosu” (2011, Rosja) Universal Astronaut Insignia za lot orbitalny (nr 211) – Stowarzyszenie Uczestników Lotów Kosmicznych ()