Istotnym okresem rozwoju klasztoru był XVI wiek, kiedy monaster otrzymał najpierw w 1521 nadanie jednej z wsi pod Ugliczem od tamtejszego kniazia Dymitra, a następnie, w 1528, pieniądze na budowę nowych murowanych zabudowań od księcia moskiewskiego Wasyla III. W tym czasie zakonnicy od podstaw wybudowali nowy, murowany kompleks budynków, w tym sobór św. Nikity. Dobroczyńcą monasteru był również car Iwan Groźny, który kilkakrotnie do niego pielgrzymował razem z rodziną, a także planował w razie potrzeby na nowo wykorzystać obronne możliwości budynków. W latach 1560–1564 z carskiego rozkazu powstały kolejne cerkwie w obrębie monasteru, której patronem został Nikita Słupnik. Ikonę tego ostatniego sfinansowała żona cara Anastazja Romanowa. Rozbudowany klasztor przetrwał polskie oblężenie w 1609, jednak został w dwa lata później spalony przez wojska litewskie.
W latach 1630–1639 przełożonym klasztoru był prawdopodobnie późniejszy patriarcha moskiewski i całej Rusi Józef.