XVII-wieczna drewniana cerkiew spłonęła w 1806.
Parafię prawosławną oficjalnie reaktywowano dopiero w 1838 (w związku z likwidacją unii na Białostocczyźnie). Stanowiły ją następujące miejscowości: Drohiczyn, Chutkowice, Chrołowice, Lisowo, Klekotowo, Putkowice, Bujaki, Sieniewice, Runice, Tonkiele, Kłyzówka, Zajęczniki i Minczewo. Cerkiew św. Mikołaja dostosowano do potrzeb liturgii prawosławnej. Parafia weszła w skład dekanatu drohiczyńskiego diecezji litewskiej Rosyjskiego Kościoła Prawosławnego. Oprócz cerkwi św. Mikołaja, parafia posiadała jeszcze dwie wolnostojące świątynie: filialną św. Barbary i cmentarną św. Anastazji (obie uległy zniszczeniu podczas II wojny światowej). Na terenie parafii działały szkoła oraz szpital (z kaplicą św. Agapita Pieczerskiego), prowadzone przez mniszki prawosławne. W 1898 otwarto dwuklasową szkołę cerkiewną z kaplicą św. Nikanora.
Parafia przerwała działalność w 1915, wskutek udania się duchowieństwa i ludności prawosławnej na bieżeństwo. W okresie międzywojennym wspólnota prawosławna w Drohiczynie należała do (nieetatowej w owym czasie) parafii Świętych Kosmy i Damiana w Narojkach. Reaktywacja parafii nastąpiła w czasie II wojny światowej.
W latach 80. XX w. dokonano remontu wnętrza cerkwi, m.in.