Sekwencjonowanie DNA – technika odczytywania sekwencji, czyli kolejności par nukleotydowych w cząsteczce DNA.
Sekwencjonowanie dokonuje się obecnie głównie za pomocą zautomatyzowanych sekwenatorów i jest wykorzystywane m.in. w diagnostyce nowotworów. Manualne sekwencjonowanie stosuje się przy opracowywaniu nowatorskich metod, w niektórych laboratoriach dla krótkich fragmentów lub podczas ćwiczeń.
Przykład sekwencji DNA (początek operonu laktozowego E. coli z GenBank): GACACCATCGAATGGCGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAAGAGAGTCAATTCAGGG gdzie: A – deoksyadenozyna; C – deoksycytydyna; G – deoksyguanozyna; T – tymidyna.
Metody historyczne thumb|300px|Sekwencjonowania DNA metodą Sangera z użyciem znakowanych dideoksynukleotydówA – przykładowa sekwencja DNAB – przyłączenie startowego oligonukleotydu do nici matrycowej i kierunek syntezy DNAC – produkty syntezy DNA, zakończone fluorescencyjnie znakowanymi dideoksynukleotydami (kolorowe litery)D – elektroforegram rozdziału otrzymanej mieszaniny fragmentów w elektroforezie kapilarnej wraz z zidentyfikowaną sekwencją (powyżej) thumb|300px|Przykładowy pirogram uzyskany z pirosekwencjonowania Historyczną już i wypieraną metodą jest opracowana w 1977 r. metoda Sangera, oparta na syntezie DNA przez polimerazę DNA in vitro.