Jest to jednoczesna reakcja utleniania i fosforylacji, która może być zmodyfikowana w obecności arsenianu – reaguje on z nieorganicznym fosforanem i tworzy 1-arseno-3-fosfoglicerynian i – zamiast ATP – energię cieplną. Reakcja utleniania jest korzystna termodynamicznie i wykazuje zmianę standardowej energii swobodnej ΔG°' około -50 kJ mol−1. Reakcja ta przebiega w dwóch etapach. W pierwszym z nich aldehyd 3-fosfoglicerynowy łącząć się z grupą tiolową Cys-149 tworzy hemitioacetal. W drugim etapie jon wodorkowy przenoszony jest na NAD+ połączonym z enzymem w pobliżu reszty cysteiny. W oderwaniu protonu od hemiacetalu bierze udział His-176. Druga reakcja wiąże się ze zmianą standardowej energii swobodnej o podobną wartość z przeciwnym znakiem. Sprzężenie obu reakcji jest możliwe dzięki produktowi pośredniemu o charakterze tioestru. Tioestrowy związek pośredni reaguje z ortofosforanem tworząc acylofosforan. W wyniku połączenia z ortofosforanem zostaje uwolniona reszta Cys-149 i powstaje 1,3-bisfosfoglicerynian. Do połączenia może jednak dość tylko gdy powstały w pierwszej reakcji NADH odłączy się od enzymu, a w jego miejsce przyłączy się kolejna cząsteczka NAD+. To właśnie dodatni ładunek dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego ułatwia przyłączenie ortofosforanu.