Jest konstytutywna, co oznacza, że dostarcza stałą, niezależną od czynników indukujących syntezę, ilość NO.
Funkcja thumb|447px|Mechanizm reakcji katalizowanej przez syntazy tlenku azotu. Syntaza tlenku azotu produkuje NO katalizując reakcję pięcioelektronowej oksydacji azotu L-argininy (L-Arg). Oksydacja L-Arg do L-cytruliny zachodzi poprzez dwa etapy monooksygenacji, produktem pośrednim jest Nω-hydroksy-L-arginina (NOHLA). 2 mole O2 i 1,5 mola NADPH jest zużywanych do syntezy 1 mola NO.
L-Arg + NADPH + H+ + O2 → NOHLA + NADP+ + H2O NOHLA + ½ NADPH + ½ H+ + O2 → L-cytrulina + ½ NADP+ + NO + H2O
Budowa Wszystkie trzy izoformy enzymu (z których każda aktywowana funkcjonuje jako homodimer) posiadają C-końcową domenę o aktywności reduktazowej, homologiczną do białka reduktazy cytochromu P450. Na N-końcu znajduje się domena oksygenazowa zawierająca hem jako grupę prostetyczną, w środku łańcucha polipeptydowego NOS znajduje się natomiast domena wiążąca kalmodulinę. Związanie kalmoduliny działa jak "molekularny przełącznik", umożliwiając przepływ elektronów z reszty flawinowej grupy prostetycznej na domenę reduktazową połączoną z hemem. Proces ten ułatwia przekształcenie O2 i L-argininy w NO i L-cytrulinę.