W okresie sanacji na terenie Polesia istniał obóz w Berezie Kartuskiej, w którym internowano opozycyjnych działaczy. W twierdzy brzeskiej w Brześciu nad Bugiem osadzono aresztowanych w 1930 r. przywódców Centrolewu, osądzonych następnie w procesie brzeskim.
W czasie wojny obronnej 1939 trudno dostępne Polesie z twierdzą w Brześciu nad Bugiem stanowiło jeden z ostatnich obszarów obrony wojska polskiego. W dniach 14–17 września miała miejsce obrona twierdzy brzeskiej przed oddziałami niemieckimi. W dorzeczu Prypeci sformowano Samodzielną Grupę Operacyjną „Polesie” pod dowództwem gen. Franciszka Kleeberga. Po agresji sowieckiej 17 września grupa „Polesie” walczyła z dwoma najeźdźcami. Stoczona przez nią bitwa pod Kockiem (2–6 października) była ostatnią bitwą kampanii wrześniowej.
22 września 1939 w Brześciu odbyła się wspólna parada zwycięstwa Wehrmachtu i Armii Czerwonej. W wyniku porozumień niemiecko-sowieckich całe terytorium Polesia znalazło się pod okupacją sowiecką. Większość terenu została włączona do Białoruskiej Republiki Radzieckiej, natomiast południowy pas ziemi (okolice Klesowa, Rokitnego, Saren) został włączony do Ukraińskiej SRR. W okresie okupacji niemieckiej od 1941 do 1944 roku Polesie podległe było Komisariatowi Rzeszy Ukraina z siedzibą w Równem.