W 1596 arcybiskup połocki Herman Zahorski podpisał akt unijny, przechodząc do nowo utworzonego Kościoła unickiego razem z całą administraturą. Nie oznaczało to automatycznego przyjęcia unii przez prawosławne mieszczaństwo Połocka; postępy unii były w mieście i w regionie powolneT. Kempa, Czy męczeńska śmierć arcybiskupa Jozafata Kuncewicza przyczyniła się do rozwoju unii brzeskiej na obszarze archidiecezji połockiej? [w:] Kościoły wschodnie w Rzeczypospolitej XVI-XVIII wieku. Zbiór studiów, Instytut Europy Środkowo-Wschodniej, Lublin 2005, , s.99 i 104-105. W 1617 unickim biskupem połockim został Jozafat Kuncewicz. Jego gorliwość przy szerzeniu unii, połączona ze stosowaniem administracyjnych środków nacisku, doprowadziła do zaostrzenia się konfliktu prawosławno-unickiego. W 1623 hierarcha zginął w Witebsku z rąk tłumu prawosławnych mieszczan. W następstwie tego wydarzenia władze odebrały prawosławnym wszystkie świątynie w Połocku, Witebsku i Mścisławiu.
Począwszy od 1633 na terytorium unickiej archidiecezji połockiej funkcjonowała równolegle prawosławna eparchia mścisławska, mohylewska i orszańska (białoruska).
W 1705 r. miała tu miejsce masakra bazylianów dokonana przez cara Piotra I, który zamierzał zniszczyć Kościół unicki.