Już pierwszego dnia II wojny światowej, 1 września 1939, kiedy wczesnym rankiem nad Białowieżą przeleciały dwa samoloty niemieckie, zrzucając bomby, świątynia została znacznie zniszczona. Z dwóch pocisków, które trafiły w świątynię, jeden eksplodował wewnątrz. Prace remontowe podjęto w czerwcu 1943: odnowiono malowidła ścienne, ikony, naprawiono ikonostas, królewskie wrota. Nowe wyświęcenie świątyni miało miejsce 17 października 1943. Wzięli w nim udział również miejscowi przedstawiciele władz niemieckich.
Okres okupacji niemieckiej zaznaczył się jednak tragicznymi wydarzeniami w historii Białowieży – był czasem masowych egzekucji, a jedno z miejsc straceń usytuowane było u wejścia na plac cerkiewny (obecnie upamiętnia je głaz z tablicą pamiątkową). Na przycerkiewnych drzewach mocowano szubienice, na których wieszano skazańców. Każda egzekucja odbywała się na oczach mieszkańców, których spędzano z całej Białowieży. Pierwszej egzekucji na drzewach przy cerkwi dokonano 9 września 1942, ostatniej 17 września 1943. Ogółem powieszono w tym miejscu ponad 90 osób.